陳潤娟，雷婭偉，白小明，袁承華，田彥鋒

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

白小明為通訊作者。

溫度作為植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，參與植物的新陳代謝、蒸騰作用、礦質(zhì)元素吸收，以及所有的酶促反應(yīng)、休眠和生長發(fā)育[1]。溫度過低對植物的傷害是一個世界性的問題，也是農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境限制因子。在草坪產(chǎn)業(yè)中，低溫脅迫不僅影響草坪的綠期和質(zhì)量，嚴重時還能使草坪草植株死亡，導致建坪失敗。在我國北方，大部分地區(qū)冬季寒冷干旱，草坪草的安全越冬受到威脅，而春秋兩季氣溫不穩(wěn)定，寒流侵襲又使草坪經(jīng)常出現(xiàn)春季返青晚、秋季早衰的現(xiàn)象，致使草坪生長不良，甚至嚴重退化，影響草坪的整體美觀，降低草坪的綠期和使用價值[2]。提高草坪草耐寒性的方法一是選育耐寒品種，二是通過施加外源物質(zhì)來提高其抗性。一氧化氮(NO)作為一種脂溶性和微水溶性小分子氣體，過去一直被認為是有毒分子，直到1998年，諾貝爾生理學醫(yī)學獎授予了在動物NO信號轉(zhuǎn)導途徑方面做出突出貢獻的3位科學家，此后人們逐漸發(fā)現(xiàn)作為一個非傳統(tǒng)的重要信號分子[3]，NO廣泛參與了植物體內(nèi)多種生理過程的調(diào)節(jié)，尤其在逆境條件下，其作用更為顯著[4-6]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為采自甘肅定西市安定區(qū)的野生草地早熟禾，采集地生境為山坡，海拔2 490 m，地理坐標N 35°20.41′，E 104°05.26′。

1.2 試驗設(shè)計

試驗中以亞硝基鐵氰化鈉(SNP，Sigama公司，分

析純)為NO供體(產(chǎn)生NO)，亞鐵氰化鈉(sodium ferrocyanide，縮寫為SF)為SNP類似物(不產(chǎn)生NO)，牛血紅蛋白(Hb)為NO清除劑，鎢酸鹽(tungstate，縮寫為T)為硝酸還原酶活性抑制劑，N-硝基-L-精氨酸甲脂(NG-nitro-L-Arg-methyl ester，L-NAME)為一氧化氮合酶抑制劑，以上化學試劑均購于Sigma 公司。試驗設(shè)13個處理(表1)。

表1 試驗處理

供試材料幼苗培育采用盆栽沙培方式，花盆直徑11 cm，深11 cm。幼苗生長3個月后選取長勢整齊一致，無病蟲害的幼苗修剪至8 cm，進行處理。各處理液用量為80 mL,用噴霧器噴施于供試材料葉面，用塑料薄膜覆蓋植株在20℃培養(yǎng)箱保濕2 h。連續(xù)噴施3 d,1次/d,第4 d將經(jīng)過處理的材料從培養(yǎng)箱中取出,在4℃智能型光照培養(yǎng)箱(SPX-300-GB，上海躍進醫(yī)療器械有限公司，中國)進行低溫脅迫6 d(處理的第0、2、4、6 d進行澆灌)，20℃為對照。每個處理4盆，重復4次，6 d 后取生長一致的幼苗測定相關(guān)生理生化指標。

1.3 測定指標與方法

(1)丙二醛(MDA)含量測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[14]。

過氧化氫(H2O2)含量，參照文獻[16]的方法進行。

羥自由基(·OH)含量，參照文獻[17]的方法進行。

(3) 抗氧化物酶活性 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照文獻[18]的方法測定。

過氧化物酶(POD)活性，參照文獻[19]的方法測定。

過氧化氫酶(CAT)活性，參照文獻[20]的方法測定。

抗壞血酸氧化物酶(APX)活性，參照文獻[21]的方法測定。

谷胱甘肽還原酶(GR)活性，參照文獻[22]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性檢驗，Excel制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量的影響

4℃低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA含量顯著高于CK(P<0.05)，是CK的1.68倍，說明低溫脅迫促進了葉片膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累。施入SNP后MDA含量明顯降低(P<0.05)，比4℃處理下降25.07%。低溫脅迫下施用牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME，葉片MDA含量顯著升高(P<0.05)，分別比4℃處理提高27.82%，23.19%和23.87%，添加SNP后膜脂過氧化程度降低，MDA含量均下降到了4℃處理水平，分別為14.00，13.83和13.57 μmol/g。亞鐵氰化鈉處理下草地早熟禾葉片MDA含量為14.54 μmol/g，與4℃處理無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片MDA的影響Fig.1 Effect of nitric oxide on malondialdehyde content in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同

2.2 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片自由基的影響

圖2 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片H2O2、·OH含量及產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effect of nitric oxide on the content of H2O2 and OH- and · emission rate in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

2.3 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、APX和GR等抗氧化酶是植物體ROS清除系統(tǒng)的重要組成部分，許多研究表明，低溫能引起氧化脅迫并且改變抗氧化酶的活性，NO能調(diào)控抗氧化酶活性，緩解氧化脅迫的傷害。低溫脅迫下草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性顯著增強，分別比CK提高了39.59%、69.26%、106.43%、71.15%，施入SNP后SOD、POD、APX和GR活性進一步的升高(P<0.05)，分別比4℃低溫脅迫提高了31.87%、38.54%、64.66%、113.19%；低溫脅迫下牛血紅蛋白、鎢酸鈉和L-NAME處理則抑制了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，再添加SNP則抑制作用被緩解，SOD、POD、APX和GR活性又增強。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾葉片中SOD、POD、APX和GR活性與CK相比則顯著提高，增幅分別37.55%、70.68%、122.62%、83.86%，與對應(yīng)的4℃低溫處理無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 NO對低溫脅迫下草地早熟禾葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of nitric oxide on antioxidant enzymes activity in leaf of kentucky bluegrass under low temperature stress

3 討論

NO作為植物中廣泛存在的一種正常代謝物和重要的信使分子,與非生物脅迫下植物體內(nèi)ROS代謝的調(diào)控有關(guān)，可以緩解各種脅迫造成的氧化損傷，增強植物的適應(yīng)能力[28]。劉開力等[29]報道，外源NO可通過提高水稻(Oryzasativa)幼苗根組織的抗氧化能力來緩解鹽脅迫下的氧化損傷。馬向麗等[30]研究證實，外源NO處理能顯著提高SOD，CAT和POD三者的活性，從而增強一年生黑麥草的抗冷性。本研究表明，SNP處理提高了草地早熟禾葉片SOD、POD、APX和GR活性，增強了低溫脅迫下清除活性氧的能力，由于保護酶活性上升，清除有害自由基，MDA的生成減少，膜系統(tǒng)受到保護；另一方面，MDA的減少可能使保護酶的活性上升，增強膜系統(tǒng)保護酶的功能，兩者相輔相成。

亞鐵氰化鈉是SNP的類似物，在生物體中分解后除不產(chǎn)生NO外，其他的產(chǎn)物與SNP相同[31]。低溫脅迫下亞鐵氰化鈉處理草地早熟禾對MDA、自由基和抗氧化酶活性均無明顯影響，進一步說明緩解低溫脅迫下草地早熟禾氧化損傷作用的物質(zhì)是NO，這與周萬海等[32]在苜蓿鹽脅迫上的研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

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