劉詩穎，陳 杰，李賡覓，黃伍蓉，簡 燚，呼永河，吳麗娟

我國西南地區(qū)氣候環(huán)境復(fù)雜，每年夏季都會出現(xiàn)持續(xù)的高溫高濕天氣，平均每年有30天日平均氣溫高于33℃，最高可達41℃以上，并且全年濕度偏高，在梅雨季節(jié)期間常常持續(xù)20天以上濕度接近100%[1]。高溫高濕環(huán)境作為一種特殊的外界因素嚴(yán)重擾亂機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致重要器官如腦、心、肺、肝、腎等的功能紊亂，甚至引起衰竭并危及生命[2-4]。既往研究主要集中在討論高溫高濕環(huán)境對創(chuàng)傷[5-7]或某一特定臟器及細胞免疫功能[8-9]的影響，本研究旨在通過檢測極端高溫高濕環(huán)境下Wistar大鼠血生化及病理指標(biāo)的改變，從生理和病理的整體水平上探究高溫高濕環(huán)境急性傷害對Wistar大鼠的影響，為下步深入探討高溫高溫急性傷害的機理研究提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，170-190g，購自成都達碩生物科技有限公司[實驗動物許可證號scxk(川)2008-24]。在試驗過程中，按試驗動物使用的“3R”原則給以實驗鼠人道主義關(guān)懷。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器

多段編程人工氣候箱，型號RXZ-1000A，購自中國寧波江南儀器；全自動生化儀，型號AU5800，購自BECKMAN公司。

2 方 法

2.1 極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選

將人工氣候箱條件設(shè)置為RH =(95±2)%，T分別設(shè)置為(30±0.5)℃、(32±0.5)℃、(34±0.5)℃、(36±0.5)℃。將12只Wistar大鼠放入不同溫度條件的人工氣候箱中飼養(yǎng)72h，要求實驗鼠每天置于箱內(nèi)24小時。觀察并記錄動物死亡情況，根據(jù)死亡情況篩選適宜的研究條件。

2.2 高溫高濕環(huán)境暴露對Wistar大鼠生化和病理指標(biāo)的影響

按照“極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選”方案，將人工氣候箱條件設(shè)置為[RH=(95±2)%，T=(34±0.5)℃]。將13只Wistar大鼠暴露于人工氣候箱中，要求實驗鼠每天置于箱內(nèi)24小時，實時觀察記錄死亡情況，當(dāng)超過半數(shù)動物死亡時停止實驗，剩余存活的大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，進行腹主動脈取血，離心收集血清進行生化指標(biāo)測定。同時收集存活大鼠的心、肺、腎、腦、腸及肌肉組織置于4%多聚甲醛中固定，進行病理檢測。另外，實驗設(shè)置常溫常濕組[T=(25±0.5)℃，RH=50±2%]作為對照。

2.3 指標(biāo)測定

鉀(K)、鈉(NA)、氯(CL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、缺血修飾白蛋白(IMA)、肌酸激酶(CK)、超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)試劑盒均購自北京九強生物技術(shù)有限公司。所有指標(biāo)均在BECKMAN COULTER AU5800 全自動生化儀上檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 極端高濕環(huán)境下適宜研究溫度的篩選

在極端高濕(RH=95%)條件下，Wistar大鼠暴露于30℃及32℃環(huán)境72 h未出現(xiàn)死亡；34℃條件下暴露24 h開始出現(xiàn)死亡，且死亡率隨著暴露時間的延長而上升，暴露72 h后死亡率達到83%，顯著高于30℃和32℃組(P<0. 05)；36℃條件下暴露12 h死亡率突然躍升到92%，72 h時死亡率已經(jīng)達到100%，顯著高于30℃和32℃組(P<0. 05)，而與34℃組無顯著性差異(P>0. 05)。

*與30℃和32℃組比，P<0. 05

3.2 高溫高濕環(huán)境對Wistar大鼠血生化指標(biāo)的影響

將13只Wistar大鼠暴露于[RH=(95±2)% / T=(34±0.5)℃]環(huán)境中，到46 h時死亡7只，取剩余6只存活大鼠血液進行生化指標(biāo)的檢測(見表1)。生化結(jié)果顯示，與常溫常濕對照組相比，高溫高濕環(huán)境下暴露46 h后Wistar大鼠血鉀(K+)和缺血修飾白蛋白(IMA)水平均顯著降低(P<0. 05)，而總膽紅素(TBIL) 和肌酐(CREA)水平均顯著升高(P<0. 05)，其它生化指標(biāo)無顯著差異(P>0. 05)。

表1 Wistar大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果

3.3 高溫高濕環(huán)境對Wistar大鼠病理指標(biāo)的影響

Wistar大鼠在高溫高濕環(huán)境[RH=(95±2)% /T=(34±0.5)℃]中暴露46h后，解剖發(fā)現(xiàn)大多數(shù)死亡動物存在肺部充血、胃腸腫脹、肝臟淤腫現(xiàn)象(見圖2)。經(jīng)病理檢測后發(fā)現(xiàn)心臟組織心肌間質(zhì)水腫，伴有炎性細胞浸潤，部分心肌細胞發(fā)生退變，肌纖維溶解；肺組織間質(zhì)結(jié)構(gòu)增寬，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤；腎組織間質(zhì)出血明顯；腸組織在粘膜層可見嗜酸性粒細胞和大量漿細胞、淋巴細胞浸潤，間質(zhì)水腫、出血；而腦和肌肉組織均未見明顯病理學(xué)改變(見圖3)。

A：心；B：肺；C：腎；D：腦；E：腸；F：肌肉；G：脾；H：肝

A：高溫高濕組；B：常溫常濕組；

4 討 論

高溫高濕環(huán)境會對人體健康產(chǎn)生不良影響，其根本原因是環(huán)境溫度超過了體表溫度，導(dǎo)致機體不僅無法進行正常的散熱，還會從熱環(huán)境中獲得能量使人體免疫功能減退，同時大量水汽使體表汗液蒸發(fā)困難，加重機體對溫度的敏感性。

有研究發(fā)現(xiàn)[10]，當(dāng)環(huán)境溫度大于30℃時，相對濕度每增加10%，對機體帶來的熱影響，相當(dāng)于環(huán)境溫度增加1～1.5℃。30℃的環(huán)境溫度便可使安靜狀態(tài)下的人體體溫升高，35℃時這種影響非常顯著，故認(rèn)為高濕度對生理產(chǎn)生不良影響的溫度界限是35℃。本研究發(fā)現(xiàn)在高濕環(huán)境中(RH=95%)，30℃和32℃的研究溫度作用過于溫和，36℃作用過于猛烈，均不適宜開展高溫高濕急性傷害研究；34℃的研究溫度既能在短時間內(nèi)對大鼠造成損傷，死亡又不會過于迅速，便于采集標(biāo)本，因此本研究選擇[RH=(95±2)% /T=(34±0.5)℃]的實驗條件較為合適。

本研究發(fā)現(xiàn)濕熱環(huán)境暴露46h后K+離子濃度顯著下降，這可能是由于在高溫高濕環(huán)境下大鼠呼吸頻率加快，血中CO2的排出量增多，血液中H+、HCO3-濃度下降，pH值升高，為了保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，機體通過泌尿作用排出Na+、K+等堿性離子，而伴隨著血漿滲透壓下降和動物大量飲水，醛固酮的保鈉排鉀作用使K+濃度進一步下降，Na+濃度總體變化不大。血肌酐的濃度變化主要由腎小球的濾過能力來決定，我們推測高溫高濕環(huán)境暴露可能對腎臟造成了損傷使濾過率下降，導(dǎo)致血肌酐濃度顯著升高，在病理檢測中我們也發(fā)現(xiàn)腎臟出現(xiàn)了明顯的間質(zhì)出血現(xiàn)象。同樣，總膽紅素水平的升高也提示了高溫高濕環(huán)境對肝臟的傷害。缺血修飾白蛋白(IschemiaModifiedAlbumin，IMA)是指示心肌缺血的靈敏指標(biāo)，IMA的形成與血液中游離的Cu2+含量有關(guān)，在濕熱環(huán)境中血液PH值升高，導(dǎo)致Cu2+無法從循環(huán)蛋白的金屬結(jié)合位點釋放，從而阻礙了IMA的生成，同時熱應(yīng)激還能誘發(fā)釋放多種內(nèi)源性活性物質(zhì)抵抗心肌缺血損傷[11]，如腺苷[12]、一氧化氮[13]等。

研究還發(fā)現(xiàn)高溫高濕環(huán)境暴露46h后心臟、肺及腸道存在明顯的炎性細胞侵潤，我們推測這可能是由于濕熱環(huán)境暴露導(dǎo)致全身血流重新分配，胃腸道血流量下降，使其發(fā)生缺血缺氧性損害，最終造成腸道屏障作用減弱，通透性增加，致使腸道內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素能夠自由地進入循環(huán)系統(tǒng)，移位至血液內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素可以激活機體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)單核細胞、中性細胞分泌活性細胞因子如TNF-α，TNF-α可以刺激其他細胞因子如IL-4，IL-6等的釋放，擴大其生物學(xué)效應(yīng)，介導(dǎo)出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進而引起多器官功能障礙綜合征(MODS)[14]。

多數(shù)研究者認(rèn)為發(fā)生熱應(yīng)激時機體會產(chǎn)生大量的自由基，使細胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致其通透性增高，各組織細胞分泌的酶釋放進入血液，成為細胞受損的標(biāo)志物。然而本研究中包括CK、ALT、AST等在內(nèi)的酶類并沒有顯著性的改變，與韓喜彬[15]等的研究結(jié)果相差較大，這可能是由于溫濕度差異或者熱暴露時間的不同引起的，不同的溫度也可以直接影響酶的含量或活性。這說明我們的研究還存在有待完善的地方，接下來的研究中我們希望通過延長環(huán)境暴露時間并動態(tài)檢測各時間點大鼠血生化和病理指標(biāo)的改變，找到變化最顯著的時間點，更進一步地從轉(zhuǎn)錄組水平探討高溫高濕急性傷害的分子機制，從而為高溫高濕急性傷害研究奠定理論基礎(chǔ)。

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