□ 郭 慧 鄂爾多斯市藥品醫(yī)療器械檢驗研究中心

在現(xiàn)代社會中，伴隨著人們生活水平的提高以及食品行業(yè)的快速發(fā)展，人們對食品安全的要求日益提高，再加上最近幾年來食品安全問題頻發(fā)，使得食品安全問題成為了人們關(guān)注的焦點問題。無論是在傳統(tǒng)的發(fā)酵食品還是在現(xiàn)代的新型發(fā)酵產(chǎn)品中，都可能潛在微生物等，每年由于微生物而造成的食品安全問題時有發(fā)生。公眾的關(guān)注點已不再僅停留在食品的安全問題上，開始逐漸轉(zhuǎn)向?qū)κ澄锏臓I養(yǎng)健康評價，如對褪黑素、膳食補充劑、銀杏葉提取物等保健食品及對糖等常見基礎(chǔ)食品原料的關(guān)注。對此，運用快速檢測食品微生物的方法檢測食品安全具有十分重大的意義。本文簡單介紹和分析了幾種新型的且具有發(fā)展?jié)摿Φ氖称肺⑸锟焖贆z測方法及其應(yīng)用。

1 分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

所謂分子生物學(xué)技術(shù)，是指在基因水平上對目標(biāo)微生物進行檢測，特別是對于一些難以培養(yǎng)或者抗原結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的微生物，可以對其進行鑒定和分型。此種方法最早是在1996年應(yīng)用于食品微生物的檢測檢驗中。分子生物學(xué)技術(shù)主要包括常規(guī)PCR及其衍生技術(shù)、核酸探針技術(shù)以及基因芯片等技術(shù)。

1.1 常規(guī)PCR技術(shù)

所 謂 PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。由于其特性，它在20世紀(jì)末就已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品微生物的檢測中。目前，PCR技術(shù)在食品微生物檢測中被用于乳制品的乳酸菌和雙歧桿菌的精確檢測和鑒定、酒類中酵母菌的檢測以及水源中大腸桿菌及其群體的測定等[1]。

1.2 PCR衍生技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新技術(shù)也相繼出現(xiàn)，PCR技術(shù)在發(fā)展的過程中不斷和其他技術(shù)相結(jié)合，形成一些新的PCR衍生技術(shù)。比如，實時熒光PCR技術(shù)（qRT-PCR技術(shù)）、PCR變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCRDGGE技術(shù)）、多重引物PCR技術(shù)（Multiplex-PCR技術(shù)）以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）等。

1.2.1 實時熒光PCR技術(shù)

qRT-PCR實時熒光技術(shù)最早在2006年被應(yīng)用在食品細菌的檢測領(lǐng)域中，相較于常規(guī)的PCR技術(shù)而言，其具有特異性強、污染程度低以及自動化程度高等優(yōu)勢，該技術(shù)在最近幾年來已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到致病的細菌、霉菌、酵母以及乳酸菌重要食品微生物的定性和定量指標(biāo)的檢測和鑒定中[2]。

1.2.2 PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)

PCR-DGGE技術(shù)，即PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)，是把PCR技術(shù)和變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)聯(lián)合起來形成的一種新型檢測技術(shù)，理論上，只要保證具有足夠精細的電泳技術(shù)，即使只有一個堿基差異的DNA片段也可以被分開。由于PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)具有可以檢測不可培養(yǎng)的細菌、檢測率高、重復(fù)性強等優(yōu)勢，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵類食品、釀酒等食品微生物檢測以及群落研究中。

1.2.3 多重引物PCR技術(shù)

多重引物PCR技術(shù)（Multiplex PCR技術(shù)），又稱復(fù)合PCR技術(shù)，它是在同一PCR反應(yīng)體系中再加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比較而言，它具有更高效的優(yōu)點?，F(xiàn)在該技術(shù)更多應(yīng)用在食品病原微生物的檢驗檢測中。病原性食品菌主要包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以及副溶血性弧菌等。除此之外，該技術(shù)還可以被應(yīng)用到乳酸菌等食品非致病菌的檢測中。

1.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，又稱LAMP技術(shù)，是在2000年新開發(fā)的一種核酸擴增技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用到食品細菌、真菌以及寄生蟲的檢測領(lǐng)域中。

1.3 核酸探針技術(shù)

隨著分子生物學(xué)和分子化學(xué)的快速發(fā)展，對病原微生物的檢測和鑒定已經(jīng)不僅僅局限于外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性等檢驗，而是更深入地從分子生物學(xué)水平角度對生物大分子進行研究，在此基礎(chǔ)上建立的多種檢測技術(shù)，核酸探針（Nuclear Acid Probe）以其快速便捷而靈敏特異的優(yōu)勢而成為生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，已經(jīng)在病原微生物的檢測中得到廣泛應(yīng)用。

核酸探針技術(shù)是通過同位素或者其他方法標(biāo)記已知的核苷酸序列的DNA片段，加入已變性的被檢DNA中，在一定條件下會與該樣品中的同源序列DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而實現(xiàn)鑒定樣品中DNA的目的。這種可以特異識別特異性核苷酸序列標(biāo)記的單鏈DNA分子又被稱為核酸探針或基因探針。依照核酸分子中核苷酸的成分差異，可以分為DNA探針和RNA探針，一般而言采用的是DNA探針。而依據(jù)基因的不同也可以分為兩種，一種是可以同微生物整個DNA分子的一部分發(fā)生反應(yīng)的探針，它對某些菌屬、菌種具有特異性。另一種探針可以針對同一種微生物某一基因組的DNA進行雜交反應(yīng)，比如，編碼致病性的基因組，它只對某一微生物的菌株或者僅對某一微生物的菌屬有特異性，此種探針檢測的基因比較保守，因為它既可以在一種微生物中出現(xiàn)，也可以代表一大類群的微生物。

2 生理生化技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

生理生化技術(shù)，也可以稱為代謝學(xué)技術(shù)，它是利用菌體在代謝過程中產(chǎn)生的特異物質(zhì)和分子等變化的特點，對菌種進行檢測的方法，主要包括ATP生物發(fā)光法和微量生化法。

2.1 ATP生物發(fā)光法

腺苷三磷酸（ATP Adenosine Triphosphate）是由腺嘌呤、核糖和3個磷酸基團連接而成，水解時釋放出能量較多，是生物體內(nèi)最直接的能量來源。它存在于所有活體的生物體中，因此，可以通過測定樣品中的ATP濃度來檢測食品中的細菌數(shù)。ATP生物發(fā)光法就是利用發(fā)光光度計在ATP作用下檢測熒光素酶氧化熒光素所產(chǎn)生的熒光強度來測定菌量，其相比于傳統(tǒng)的方法具有快速簡便的優(yōu)勢，還能被應(yīng)用到大量食品樣本的菌類污染情況和食品現(xiàn)場的快速檢測等。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ATP生物發(fā)光法在最近幾年來在食品檢測領(lǐng)域中主要被用于乳制品中乳酸菌的檢測、啤酒中菌落總數(shù)的檢測以及調(diào)味品中脫水蔬菜的細菌測定等。

2.2 微量生化法

微量生化法包括微熱量技法、放射測量法等，前者是通過菌類在生長過程中所產(chǎn)生的熱量變化來鑒定菌種的方法，而放射測量法則是把菌中成長所需要的碳水化合物通過微量的放射性標(biāo)記物對其進行標(biāo)記，然后通過測定菌種在生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的CO2濃度計算出食品中的菌量，這種方法具有快速性與高精確性等優(yōu)勢。

除了以上所提及的兩種技術(shù)之外，還有電子阻抗法、接觸酶測定方法，它們憑借所具有的獨特優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于食品細菌方面的檢測。電子阻抗法因其具有高靈敏性、快速便捷性以及重復(fù)性高等特點，而被廣泛應(yīng)用到食品微生物的快速檢測中，適合用于大腸桿菌、乳酸菌和酵母菌等的定量檢測。

3 免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)是一種基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)而形成的一種檢測方法，主要是以目標(biāo)微生物的某個特異性基因的表達產(chǎn)物為對象。主要可以分為免疫磁性分離技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以及免疫層析技術(shù)等，免疫學(xué)檢測技術(shù)所具有的高效性和特異性，使得該技術(shù)在未來的食品微生物檢測中具有良好的發(fā)展空間。

3.1 免疫磁性分離技術(shù)

近幾年來，免疫學(xué)技術(shù)發(fā)展形成一種新型的技術(shù)——免疫磁珠，該技術(shù)結(jié)合了固化試劑所具有的優(yōu)點以及免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性，具備高效、快速、操作性強、重復(fù)性高與成本低等優(yōu)點。

當(dāng)前，免疫磁性分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在食品樣品的致病微生物的檢測中，同時，由于該技術(shù)具備強特異性和下游良好的檢測技術(shù)已經(jīng)在多數(shù)細菌、真菌和酵母菌等主要食品微生物的快速檢測中得到廣泛應(yīng)用。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，即ELISA技術(shù)，它是將抗原、抗體反應(yīng)間的特異性以及酶的高效性結(jié)合起來的一種新型檢測技術(shù)。這種技術(shù)可以定性定量地測定待測物。

該技術(shù)采用方法有間接法、競爭法與雙抗體夾心法，前兩種方法多用于臨床診斷中，而后一種方法則是應(yīng)用在小分子抗原的測定上，在食品安全檢測中具有較為廣泛的應(yīng)用。利用單抗體克隆雙夾心法使得對海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的靈敏度提高了近千倍。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)還可以同熒光分析技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用在乳制品的檢測分析中。

4 質(zhì)譜與核磁共振技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

在后基因時代，許多基因類的學(xué)科理論，比如，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等新理論，也給新技術(shù)的產(chǎn)生提供了一定的理論和技術(shù)的支持。這里主要介紹質(zhì)譜法與核磁共振技術(shù)，它們在食品微生物的快速檢測中具有較大的發(fā)展空間。

4.1 質(zhì)譜技術(shù)

當(dāng)前質(zhì)譜技術(shù)主要應(yīng)用在海產(chǎn)品中的腐敗菌的快速檢測以及革蘭氏陽性致病菌等菌種的測定。首先對樣品中的病菌進行分離，然后利用質(zhì)譜對其進行鑒定，建立含有多個標(biāo)準(zhǔn)菌類的光譜指紋圖譜的提取峰表，屬特異性和種特異性的峰質(zhì)量數(shù)則可以被當(dāng)作快速檢測細菌的生物標(biāo)記。同時，質(zhì)譜技術(shù)還可以應(yīng)用于發(fā)酵型食品的菌種的檢驗和測定，其不僅能夠?qū)游镌措p歧桿菌的種類進行鑒定和區(qū)分，同時它也可以實現(xiàn)工業(yè)的快速檢測。

在當(dāng)前的食品微生物檢測中，質(zhì)譜法中的液相色譜分離技術(shù)以及電子噴霧三重四極桿的質(zhì)譜聯(lián)用是較為常見的，通過這些技術(shù)的合理使用可以快速地檢測出水果蔬菜、奶類肉類以及酒水中的菌類污染情況。作為新興技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)在食品安全檢測中具備一定的基礎(chǔ)，由于該技術(shù)具有快速檢測、操作便捷以及成本消耗低等優(yōu)勢，在食品微生物檢測中具有良好的發(fā)展空間。

4.2 核磁共振技術(shù)

從當(dāng)前核磁共振在食品微生物檢測中的應(yīng)用看，由于其具備快速精確且不會對原料造成損壞等優(yōu)點，其在乳制品中存在的乳酸菌檢測中通過對其進行跟蹤標(biāo)記，從而實現(xiàn)定性和定量的測定，同時，它也能對酒類的酵母菌以及蔬菜水果中存在的霉菌進行檢測，在食品安全檢測中得到廣泛應(yīng)用。

5 結(jié)語

近年來不斷出現(xiàn)食品安全問題，使得民眾對食品的安全越來越重視，同時，食品微生物的快速檢測方法在食品安全和食品衛(wèi)生檢驗中得到越來越廣泛的應(yīng)用，分子生物學(xué)、生理生化學(xué)、免疫學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)等都可能成為未來食品微生物快速檢測的有效方法，這些不斷創(chuàng)新的新興技術(shù)由于具備快速靈敏等優(yōu)點將在微生物檢測中發(fā)揮重要的作用。

[1]鄧軍.食品微生物檢驗檢測中新技術(shù)的應(yīng)用[J].糧食流通技術(shù),2016(17):77-79.

[2]楊丹,郎慧柯.PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用價值[J].食品安全導(dǎo)刊,2017(30):96.