□ 邱 純 佛山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測中心

1 前言

因質(zhì)譜儀分析大分子量蛋白質(zhì)的靈敏度較分析小分子量的勝肽低，故使用酵素對蛋白質(zhì)進行專一性的水解反應(yīng)，將大分子的蛋白質(zhì)切成小片段勝肽，消化為適當(dāng)?shù)拇笮〖伴L度（以6～20個胺基酸組成的勝肽最適合），利于儀器作出精確的判斷。胰蛋白酶Trypsin是最常使用于蛋白質(zhì)分解的蛋白酶，易于純化、產(chǎn)量高且專一性強，Trypsin剪切賴氨酸Lysine和精胺酸Arginine的碳端（C端）位置，但若與C端連接的胺基酸為脯胺酸Proline，則不水解此鍵結(jié)。許多蛋白質(zhì)中富含Lysine及Arginine，則Trypsin水解后的胰蛋白勝肽片段（Trypticpeptide），便于送入后續(xù)的質(zhì)譜儀分析，這也是Trypsin被廣泛使用的原因。

2 藥品與儀器

2.1 實驗藥品

觸媒、氫氧化鈉、檸檬酸；指示劑、己烯；30%丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、催化劑、過硫酸銨等。

2.2 儀器

熱風(fēng)循環(huán)烘箱、蛋白質(zhì)分解爐、燃燒式氮測定儀、索氏萃取裝置、高溫灰化爐、電泳槽組、電泳電源供應(yīng)器、高速均質(zhì)機、回轉(zhuǎn)式振蕩器、微量高速低溫離心機、高速離心機、干浴器、微電腦酸堿度計、超聲波水浴槽、蛋白質(zhì)減壓濃縮系統(tǒng)、超高效液相層析儀（UPLC）與雙線性離子阱組合傅立葉變換軌道阱質(zhì)譜儀。

3 實驗方法

3.1 粗蛋白質(zhì)

使用水分測定后干燥完成的樣品，秤取樣品約0.5 g于燃燒式氮測定儀專用的錫箔紙中，封口成形后置入燃燒式氮測定儀中高溫燃燒。燃燒過程中生成氮氧化物、二氧化碳、水及無機物，經(jīng)過一系列吸收劑去除二氧化碳、水及無機物，氮氧化物經(jīng)還原管被還原為分子氮，最后經(jīng)熱導(dǎo)檢測器檢測出氮分子含量（N），乘以蛋白質(zhì)系數(shù)5.95，即可得粗蛋白質(zhì)含量。

粗蛋白質(zhì)含量（%）=N×5.95%

3.2 蛋白質(zhì)檢測

在微量離心管中加入80 μL清洗溶液清洗膠體碎片，振蕩1 min，再用微量吸管移除清洗溶液。重復(fù)加入清洗溶液和移除溶液2次，盡量移除微量離心管中的溶液。接著加入15 μL二硫蘇糖醇溶液，靜置10 min，讓膠片吸收溶液，將微量離心管放入干浴器中于55 ℃下反應(yīng)30 min。使用微量吸管移除溶液，再加入15 μL碘乙酰胺溶液，放置在黑暗環(huán)境中于室溫下反應(yīng)60 min。吸除微量離心管中的溶液，加入100 μL清洗溶液后振蕩，重復(fù)吸除溶液并加入清洗溶液直到微量離心管中的膠片碎片變成透明無色。使用蛋白質(zhì)減壓濃縮系統(tǒng)，將微量離心管中的溶液完全抽干后，加入15 μL胰蛋白酶溶液與10 μL的25mM緩沖溶液，放入37 ℃水浴槽中反應(yīng)6 h，使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生勝肽[1]。

3.3 液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀分析

流速為10 μL/min；使用二次水和乙腈作為移動相，起始移動相為98%二次水、2%乙腈，在50 min內(nèi)將移動相內(nèi)乙腈濃度升高至95%。

游離源設(shè)定為正電模式、溫度為90 ℃、電壓則是2.8 kV；質(zhì)譜掃描范圍設(shè)定為350～2 000 Da，收集2+至6+離子訊號。

4 結(jié)果

燕麥脫脂粉末及其酸、堿蛋白質(zhì)分離物與上清液的電泳分析結(jié)果，于約50 kDa處對應(yīng)為11Sglobulin（Chenopodin），其由A、B兩個次單 元（Subunit） 所 組 成，A-subunit分子量為 30～ 40 kDa、B-subunit分子 量 為 20～ 25 kDa。A、B Subunit會于后續(xù)的合成步驟形成Chenopodin（約50 kDa）。其中堿萃?。˙P）及酸萃?。ˋP）蛋白質(zhì)分離物的Lane，皆于28～35 kDa處有兩條明顯的Band、20～25kDa處有三條明顯的Band，推測其各對應(yīng)為11Sglobulin A、Bsubunit，于約50 kDa處也可發(fā)現(xiàn)Chenopodin的存在。

5 結(jié)論

以堿萃取方式所得的燕麥蛋白質(zhì)分離物，較酸萃取方式具較高的蛋白質(zhì)含量（94.25%）及產(chǎn)率（32.29%）。蛋白質(zhì)體學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)用于檢測燕麥中的蛋白質(zhì)，液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀分析出的Trypticpeptide對應(yīng)于四種蛋白質(zhì)：11S種儲存球蛋白、GBSSIb蛋白、乙酰羥酸合成酶（AHAS）、甜菜堿醛去氫酶（BADH）。通過質(zhì)譜技術(shù)得知蛋白質(zhì)序列搭配生物信息工具，可以分析序列中的活性勝肽，探討實驗素材用于生產(chǎn)活性勝肽的潛力，可以減少實驗時間和藥品、材料的浪費，并有助于從蛋白質(zhì)中生產(chǎn)特定活性的功能性勝肽。

[1]李景梅.偶氮氯膦-Ⅲ分光光度法測定蛋白質(zhì)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版),2015(6).