龐 龍，張軍峰，劉博迪，郝宏博，徐 曦

（1西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，陜西西安710021；2西安交通大學(xué)能動學(xué)院，陜西西安710049）

0 引言

腦膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）是指存在于腦膠質(zhì)瘤中具有獨立成瘤能力的一種細胞［1-3］。相較于其他的腫瘤細胞，GSCs具有自我更新、無限增殖、多向分化潛能、耐藥性等特征［4-5］。研究［6-7］表明GSCs是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的“始動”細胞，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、維持、轉(zhuǎn)移擴散和復(fù)發(fā)過程中起著關(guān)鍵性作用。但是GSCs在整個腦膠質(zhì)瘤細胞中的含量極其微小，這給它的研究帶來了很大的困難［8］。目前根據(jù)分選是否需要細胞表面標記物，GSCs的分選主要可以分為細胞表面標志物分選和不依賴細胞表面標記物分選法兩種方式［8-9］，利用細胞表面標志物分選的特點是分離得到的GSCs純度高，但缺點是該方法破壞了細胞的生物化學(xué)性質(zhì)不利于后續(xù)的檢驗研究。此外，該方法必須依賴已知的標記物，而對于未知的標記物則無法進行檢驗［10］。隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，不依賴細胞表面標記物分選法得到了長足的發(fā)展。本文將結(jié)合GSCs的生物學(xué)特性對目前GSCs分選的常用方法和技術(shù)展開探討。

1 GSCs的生物學(xué)特性

作為腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSCs）的一種，GSCs擁有與腫瘤干細胞相同的生物學(xué)特性，而這些特征也是GSCs分選的依據(jù)。所謂TSCs是指存在于腫瘤細胞中的一小部分細胞，這些細胞具有自我更新、無限增殖能力以及多向分化潛能的干細胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的根源［11-12］。TSCs的概念提出于20世紀60年代，但當(dāng)時缺乏先進的分子生物學(xué)與細胞生物學(xué)實驗技術(shù)，直到21世紀初美國癌癥研究學(xué)會（American Association for Cancer Research，AACR）才正式宣布承認TSCs。這標志著TSCs得到了醫(yī)學(xué)界的公認，從而使TSCs的研究進入了一個新的階段。TSCs理論為我們重新認識腫瘤的起源、腫瘤的診斷與治療等方面提供了新方向［13］。TSCs的主要特征包括類干細胞特性、懸浮球狀生長、無限增殖能力、致瘤能力等。

1.1 類干細胞特性從某種意義上，干細胞與TSCs具有相似性［14-16］。在最初研究TSCs時發(fā)現(xiàn)它和干細胞表達相同的基因與標記物如SOX2、CD133、Nestin等［17-18］，這些標記物通常作為TSCs鑒定的主要依據(jù)之一［19-20］；研究［21-22］發(fā)現(xiàn) TSCs 和干細胞共用一些與細胞代謝、自我更新相關(guān)的信號通路，如Notch和 Wnt／β-catenin；此外，TSCs和干細胞都具有自我更新能力、增殖能力及多向分化潛能，并且兩者的增殖方式都為不對稱分裂（asymmetrical division）。

1.2 懸浮生長與無限增殖能力研究［23-24］發(fā)現(xiàn)使用神經(jīng)干細胞的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細胞時會出現(xiàn)腫瘤球。連續(xù)傳代后的腫瘤球生長速度加快，且能夠保持穩(wěn)定的聚集狀態(tài)。此外，研究［25-26］還發(fā)現(xiàn)由親本腦膠質(zhì)腫瘤干細胞球制成的單細胞懸液能夠再次培養(yǎng)形成腫瘤球，且該腫瘤球保持與親本腫瘤球一致的表型。GSCs具有無限增殖能力，這表現(xiàn)為在腫瘤組織中絕大多數(shù)的腫瘤細胞增殖能力有限，只有含量很少的GSCs才能夠形成新的腫瘤細胞群并轉(zhuǎn)移和擴散［27］。膠質(zhì)瘤干細胞可以實現(xiàn)自我更新，形成與父代相同表型的子代TSCs，與此同時膠質(zhì)瘤干細胞可以分裂增殖成腫瘤組織中大量含有的其他腫瘤細胞。

1.3 致瘤能力GSCs最大的特征是其致瘤能力。不同于腫瘤組織中其他的腫瘤細胞，含量稀少的TSCs具有很強的致瘤能力［28］。人源性腫瘤細胞的致瘤能力通常通過體外克隆形成和免疫缺陷小鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力兩個方面進行評價。其中體外克隆形成是將源自原發(fā)性腫瘤組織或細胞系的TSCs在軟瓊脂或基底膜類似物上進行培養(yǎng)，比較它們可形成的克隆數(shù)目及所形成的腫瘤球大??；免疫缺陷動物體內(nèi)的腫瘤形成能力是指將分選的相同數(shù)量的TSCs和非TSCs分別按相同方式接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察它們在相同時間內(nèi)的腫瘤形成情況。研究［19］表明，TSCs（CD133+）體外克隆明顯大于CD133-的腦腫瘤非干細胞。同時對比接種后24周內(nèi)形成可以連續(xù)移植的腫瘤，使用非糖尿病型嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（non-obese diabetic， severe combined immunodeficient，NOD-SCID），接種105個CD133-的腦腫瘤非干細胞的NOD-SCID未見腫瘤形成，而使用100個腦TSCs接種則可以形成腫瘤［5］。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、維持、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等均與 GSCs有著密切的關(guān)系［29］，可以說GSCs是導(dǎo)致腦膠質(zhì)的罪魁禍首！

2 GSCs常用的分選方法

由于GSCs在整個腦膠質(zhì)瘤中含量非常稀少，使它的分離非常困難。因此，GSCs的分選是進一步研究膠質(zhì)瘤干細胞的難點和基礎(chǔ)。按是否使用細胞表面標記物可分為細胞表面標志物分選和不依賴細胞表面標記物分選法兩種方式。下面將這兩種方法進行概述。

2.1 細胞表面標志物分選作為膠質(zhì)瘤細胞中含量較少的一個亞群，對于GSCs特異性標記物的研究一直是熱點內(nèi)容。目前已經(jīng)證實的GSCs標記主要包括：位于細胞核中的 SOX2、Olig2、BMI-1、EZH2，位于細胞質(zhì)中的 Nestin、BMX以及細胞膜表面標記物CD133、CD15、CD90、Integrin-α6、L1CAM 等［29］。 其中，細胞表面標記物對特定細胞分選是目前進行細胞分選研究最為常用的方法。這種方法是借助于已知的特殊細胞表面標志物，利用免疫磁珠或?qū)⒖膳c特殊表面標記物結(jié)合的帶熒光的“標簽”對GSCs進行標記并分選［30-32］。通常采用的方法包括免疫磁珠分選法（magnetic activated cell sorting， MACS）、熒光激活細胞分選法（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）等。

MACS進行GSCs分選主要是將GSCs表面的特異性抗原標記到免疫磁珠表面［33］，將標記過的磁珠與單細胞懸液共同孵育，使磁珠結(jié)合到GSCs表面，然后在磁場的作用下將GSCs分離出來。此外，還有一種方法是先用特殊的一抗與膠質(zhì)瘤干細胞結(jié)合，再用標記有二抗的磁珠與之結(jié)合，通過使用易降解材料制作磁珠可以降低對目標細胞的損傷。

與MACS相同，F(xiàn)ACS也是常用的一種分選方法［34-37］。FACS具體是利用細胞表面的特異性抗原，通過將帶熒光標記的特異抗體與TSCs表面特殊抗原結(jié)合，將細胞分為帶熒光標記的目標群和不帶熒光標記的細胞群，然后借助于流式細胞儀將目標細胞進行分離。由于使用了流式細胞儀，該方法又被稱為流式分選法。

采用細胞表面標志物分選的優(yōu)點是可以利用已知的確定性標記物得到純度高的膠質(zhì)瘤干細胞，給后續(xù)的膠質(zhì)瘤干細胞研究提供了良好的基礎(chǔ)［38-39］。缺點是該方法需要復(fù)雜的操作和昂貴的設(shè)備支持，如使用MACS需要制備特殊的磁珠，而使用FACS則需要使用流式細胞儀［40］。而且分離的通量受到設(shè)備和操作參數(shù)的影響，如FACS需要使用合適的電壓進行，在需要提高操作通量增加電壓時又會影響到目標細胞的活性。此外這些操作必須保證均在無菌環(huán)境下進行。

除去以上兩種方法外，還可利用啟動子驅(qū)動的熒光蛋白表達特性進行GSCs的分選。啟動子驅(qū)動熒光蛋白表達特性是通過控制GSCs特異性標志蛋白的基因啟動子構(gòu)建慢病毒載體，并用這些慢病毒載體去感染膠質(zhì)瘤細胞，通過與藥物共培養(yǎng)篩選或流式分選等方法進行分離，分離得到的細胞可以進一步培養(yǎng)［41］。該方法對于完善和證明相關(guān)標記物與GSCs之間的關(guān)系以及靶點藥物的研制有重要的意義。此外，羅丹明123（Rhodamine 123， Rho123）是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位指示劑。研究［42］表明TSCs區(qū)別于其它細胞，可以通過細胞表面的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）將線粒體染色劑Rho123主動外泵至胞外，利用Rho123結(jié)合流式細胞分選術(shù)富集干細胞的方法將低熒光亞群分選即可達到富集和分離TSCs的目的。

2.2 不依賴細胞表面標記物分選法

2.2.1 側(cè)群細胞（side population， SP）分析法 SP 分析法是一種不依賴于細胞表面標記物的分選方法［43］。其原理主要是利用GSCs高表達細胞膜ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白［44-45］，這種蛋白可以將細胞核染料Hoechst33342轉(zhuǎn)移到細胞外。這種特性使GSCs區(qū)別于其他膠質(zhì)瘤細胞，具有Hoechst33342細胞核染料拒染性，可以利用這一特征采用流式細胞術(shù)將GSCs從膠質(zhì)瘤細胞中分離出來。

2.2.2 無血清培養(yǎng)法 無血清培養(yǎng)法是利用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞，神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液中不含血清，這可以阻止其中絕大多數(shù)非膠質(zhì)瘤干細胞的增殖［46］。但這種培養(yǎng)液中添加有表皮生長因子、堿性成纖維生長因子，可以促進膠質(zhì)瘤TSCs的增殖。在這種細胞培養(yǎng)液中，GSCs可以形成致密的腫瘤球并懸浮在細胞培養(yǎng)液中；而非TSCs則貼壁生長?？赏ㄟ^多次收集懸浮腫瘤球進行克隆培養(yǎng)得到次代純度高的 GSCs［47］。

2.2.3 利用耐藥性進行分選 膠質(zhì)瘤的耐藥機制是目前已知膠質(zhì)瘤患者化療失敗的主要原因之一，而GSCs起到了關(guān)鍵作用［48-49］。這是因為GSCs通常高表達ATP結(jié)合盒（ATP-binding casette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白，如 ABCG2、ABCG1、P-糖蛋白等［50］。 這些蛋白可以將抗癌藥物“泵出”到細胞外，從而形成對抗癌藥物的耐藥性特征［51］。 Wang 等［52］利用無血清懸浮培養(yǎng)聯(lián)合低濃度長春新堿富集分離GSCs。其中長春新堿是一種細胞周期特異性藥物，可誘導(dǎo)除GSCs外的絕大多數(shù)膠質(zhì)瘤細胞凋亡或死亡，而具有耐藥性的GSCs得以保留并繼續(xù)增殖。結(jié)果表明相較以前單獨使用無血清培養(yǎng)液純化GSCs，這種方法可以縮短傳代次數(shù)，提高GSCs的純度。

3 基于微流控芯片技術(shù)的分選方法

除了上述常用的TSCs分選方法外，近年來隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，使TSCs分選方面有了更為多樣的選擇。相對于傳統(tǒng)的方法，微流控芯片技術(shù)可以將很多反應(yīng)單元集成到一塊只有幾厘米大小的芯片上進行，這使得微流控芯片具有低成本、操作簡單、高度集成的特點［53-54］。目前其在生物學(xué)領(lǐng)域特別是細胞分選方面有著廣泛的應(yīng)用。按傳統(tǒng)的分類方法可以將基于微流控芯片技術(shù)的細胞分選方法分為細胞表面標志物分選和不依賴細胞表面標記物分選法兩種方式。

3.1 細胞表面標志物分選與傳統(tǒng)的分選方法相同，基于微流控芯片分選方法的基本分選原理不變，但利用微流控芯片技術(shù)可以大大降低研究成本，并減少操作步驟，提高分選效率和通量［55-56］。使用微流控芯片進行細胞分選主要是利用特異性的標記物通過充分接觸或者流體操作的原理進行分選［57-58］。目前利用細胞表面標記物特異性地針對GSCs分選的微流控芯片還未出現(xiàn)，但是捕獲源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細胞技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)。由于源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細胞與GSCs存在著密切的關(guān)系，因此源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細胞分選技術(shù)可以給GSCs分選提供借鑒和參考。

在腦膠質(zhì)瘤細胞中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是最常被過度表達的受體酪氨酸激酶癌基因。EGFR與腫瘤細胞的遷移、粘附、侵襲的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)，并與細胞增殖、血管生成和抗凋亡機制有密切關(guān)系［59］。 Wan 等［60］設(shè)計了專門與腦膠質(zhì)瘤細胞表面EGFR特異性結(jié)合的適配子，并將其預(yù)先孵育到微管道中。適配子技術(shù)是利用人工合成的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA），或者肽鏈與非核苷酸靶目標物質(zhì)進行高親和力、高特異性的結(jié)合。借助于微流控流體操作技術(shù)可以將目標細胞捕獲到芯片中，而其他正常的細胞則被去除。Sullivan等［61］利用抗體雞尾酒法將 SOX2、Tubulin beta-3、EGFR、A2B5和c-MET的抗體孵育到CTC-iChip的流體管道表面，利用微流控流體操控技術(shù)使細胞樣品與管道表面充分的結(jié)合，從而使目標細胞被分離出來。

3.2 不依賴細胞表面標記物分選法利用不依賴細胞表面標記物分選法可以克服細胞表面標記物法破壞所分選細胞的生物化學(xué)性質(zhì)的缺點。此外，該方法還可以對于某些未知的標記進行篩選和確認。隨著對TSCs研究的深入，越來越多的研究證據(jù)表明TSCs的生物機械性能與其生物學(xué)特征密切相關(guān)［62-63］。腫瘤通過外周血循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移時，TSCs需要穿過血管內(nèi)皮細胞層到達血液中，此時細胞大小、變形性起到了關(guān)鍵作用［64-65］。此外，當(dāng)TSCs移動到次生腫瘤發(fā)生部位時，通常要與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附作用，此時TSCs粘附血管內(nèi)皮細胞的能力起到了關(guān)鍵作用［66-67］。因此，利用TSCs的生物機械性能對其進行分選，不但能夠最大限度地保留所分離細胞的生物化學(xué)性質(zhì)，而且能夠為發(fā)現(xiàn)新的TSCs標記物提供條件［68-69］。利用傳統(tǒng)的研究方法實現(xiàn)對TSCs生物機械性能的研究比較復(fù)雜且困難，而微流控芯片技術(shù)的發(fā)展則為TSCs生物機械性能的研究提供了更為方便的工具。

Zhang等［70］利用微流控芯片微柱陣列將腫瘤細胞按變形性分為變形性強亞群和變形性弱亞群。通過比較兩個亞群細胞的TSCs特征基因表達檢測、成瘤能力分析、流式細胞術(shù)TSCs含量檢測發(fā)現(xiàn)，變形性強的細胞亞群中TSCs的含量要遠遠高于變形性弱的亞群。隨后該小組又設(shè)計了一種利用細胞粘附力進行腫瘤細胞分選的微流控芯片，研究表明在特定條件下，粘附力與TSCs含量成反比，粘附力弱的細胞亞群TSCs的含量高［68］。通過微流控芯片分選不同大小的人間充質(zhì)干細胞時，小的干細胞比大的干細胞更易誘導(dǎo)成為其他的終末細胞，該發(fā)現(xiàn)首次將干細胞的大小與干細胞的生物學(xué)性質(zhì)聯(lián)系了起來［71-72］?；谝陨涎芯勘尘?，Pang等［73］設(shè)計并制備了一種能夠?qū)⒉煌笮『妥冃涡詥渭毎嚵谢奈⒘骺匦酒?。以人多形性腦膠質(zhì)瘤細胞系U-251為模板，研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤細胞的生物機械性能與其耐藥性密切相關(guān)，即小而／或變形性大的腫瘤細胞的耐藥性比大而／或變形性差的腫瘤細胞要強。這提示是否GSCs與生物機械性能也存在著密切的聯(lián)系？當(dāng)然這有待于進一步的研究證明。

4 結(jié)論與展望

GSCs在腦腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。而GSCs分選依然是TSCs研究的關(guān)鍵性技術(shù)瓶頸問題。傳統(tǒng)的方法多基于GSCs表面特異性標記物對TSCs進行分選研究。隨著對GSCs研究的進一步深入和微流控芯片細胞分選技術(shù)的發(fā)展，基于GSCs侵襲特性、細胞分裂次數(shù)異質(zhì)性、大小和變形性等非標記物分選 GSCs將得到長足的發(fā)展。未來GSCs的分選研究主要面向兩個方面：①臨床的檢測，這就要求檢測的操作更為簡單，成本更為低廉，檢測的過程更為高效，該過程只需要針對目前已知的標記物進行檢測；②科學(xué)研究，該過程對GSCs分選的研究主要集中在分選后提過的后續(xù)理論研究與藥物篩選，因此需要將分選與后續(xù)的檢驗結(jié)合起來使GSCs的研究更為便利和豐富，為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。