向菁菁，劉敏娟，毛 君，劉英華，張建林，張玉泉，李 紅，王 挺，李海波

（1南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇 蘇州215002；2江蘇南通大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南通226000）

0 引言

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示只有25%～30%的妊娠能夠最終得到活產(chǎn)，而其他70%～75%的妊娠終止在各個孕期，大部分是由于染色體異常。而對于懷孕前三個月的流產(chǎn)，約50%是由于染色體異常導致［1］。因此，對早期停止發(fā)育的胚胎進行染色體檢查對指導再次生育具有重要的意義。輔助生殖技術（assisted reproduction technology，ART）指利用醫(yī)療技術對配子、合子、胚胎進行人工操作，以達到受孕的目的，包括宮腔內(nèi)人工授精（intrauterine insemination，IUI）和體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）及其各種衍生技術。ART能夠有效治療不孕癥，在臨床上已經(jīng)得到廣泛應用，但由于高流產(chǎn)率，成功生育率仍然較低。為比較自然妊娠與輔助生殖技術妊娠早期流產(chǎn)胎兒的絨毛染色體非整倍體發(fā)生情況，本研究對自然妊娠和輔助生殖妊娠中698例早期流產(chǎn)絨毛運用CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測技術進行分析，比較兩組人群早孕期流產(chǎn)樣本染色體非整倍體情況，并進一步探討ART技術對胚胎非整倍體發(fā)生的影響。

CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測技術用于檢測染色體非整倍體，共設計有170對探針，分布在24條染色體的著絲粒兩側(cè)及染色體末端約0 Mb、10 Mb、20 Mb處進行探針設計，平均每條染色體覆蓋5～8條。該體系可用于檢測每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況，以及染色體的末端缺失或重復。2017年一篇關于CNVplex技術用于流產(chǎn)物檢測的文章中提到，CNVplex對于流產(chǎn)物的檢測結果與aCGH的結果完全一致，因此該技術可作為自然流產(chǎn)后有效的篩查方式［2］。 2017年國內(nèi)另一項研究［3］對 60例反復自然流產(chǎn)病例的絨毛樣本分別進行多重DNA拷貝數(shù)（CNVplex）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術檢測，所有樣本同時行絨毛培養(yǎng)核型分析驗證。結果48例培養(yǎng)成功的流產(chǎn)絨毛樣本中，染色體異常率為60.42%。其中48例CNV-plex檢測結果與核型分析相一致，而FISH檢測結果中與核型分析結果相符的只有38例。對于非嵌合體和非結構異常樣本，兩種方法與細胞遺傳學核型分析結果符合率分別為100%（CNVplex）和79.17%（FISH）［3］。本研究旨在通過具有更高成本效能比的檢測方法，對常規(guī)與輔助生殖流產(chǎn)的絨毛樣本檢測分析，以期揭示兩組在染色體異常方面的差異。

1 資料和方法

1.1 一般資料選擇2015年6月至2017年3月在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心門診就診，經(jīng)臨床確診為胚胎停止發(fā)育而行手術清宮的孕婦698例，年齡21～43歲，孕齡為5～15周。分成兩組：自然妊娠組和輔助生殖組，基本情況見表1，兩組年齡（P＝0.000 04）和孕齡（P ＝0.002）比較，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 兩組流產(chǎn)絨毛基本情況

1.2 方法

1.2.1 絨毛DNA的提取 挑取流產(chǎn)絨毛約15 mg，用Qiagen試劑盒提取DNA。DNA濃度和OD（260 nm）／OD（280 nm）比值用Nanodrop-1000測定，其 OD260／OD280 比值為 1.6～1.8，并將 DNA 稀釋至25 ng／μL。

1.2.2 CNVplex檢測及數(shù)據(jù)分析 采用天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司N1008人類24條染色體非整倍體檢測試劑盒。試劑盒共設計了170對探針，保證每條染色體至少被5對探針覆蓋，這些探針在1個連接反應體系中完成連接，連接產(chǎn)物隨后進行PCR反應擴增，擴增產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳分離［2］。具體實驗方法如下所述。①連接反應。每個反應孔中加入總量150 ng的相應體積的DNA樣本，并用滅菌純凈水補齊至8 μL，陰性對照直接加8 μL洗脫液。按說明書配制預混合液體系，混勻后每管分裝10.5 μL到反應孔中，置 PCR儀上進行如下反應：98℃ 2 min ；95℃ 30 s，60℃ 3 h 5 個循環(huán)；60℃保存。連接反應共15 h，反應結束后加入20 μL“終止液”終止反應并混勻。②連接產(chǎn)物多重熒光PCR擴增。對連接探針產(chǎn)物，進行多重PCR擴增。按說明書配制預混合液體系：混勻后每管分裝19 μL，加入1 μL連接產(chǎn)物，置PCR儀上進行擴增：95℃ 2 min；94℃ 20s，62℃ -1℃ ／cycle 40 s，72℃ 1.5 min 共 5 個循環(huán)；94℃20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min 共 27 個循環(huán)；68℃30 min；4℃保存。③擴增產(chǎn)物熒光毛細管電泳分離。取 1 μL 擴增產(chǎn)物稀釋液與 0.1 μL LIZ500，8.9 μL Hi-Di混勻后，95℃ 5 min變性后上ABI測序儀。④數(shù)據(jù)分析。目標峰高的數(shù)據(jù)由GeneMapper讀取，進而對樣本目的區(qū)域的拷貝數(shù)進行分析確定。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，計數(shù)資料用率表示，兩組間的比較用t檢驗，卡方檢驗或Fisher精確檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況698份流產(chǎn)絨毛中非整倍體共計308例，異常率為44.12%（308／698）。自然妊娠組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為328例，非整倍體 255 例，異常率為 43.73%（255／583）。輔助生殖組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為62例，非整倍體53例，異常率為 46.08%（53／115）。 兩組異常率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.643，表 2）。

表2 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況

2.2 流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體的類型流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體中以三體型最為常見，占78.90%（243／308）。常染色體除了1號，19號三體未被檢出，其他染色體的三體都有檢測到，最常見的為16三體，22三體和21三體。特納綜合征（45，X）也是常見的異常核型（表3）。各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中無顯著性差異（表3）。

兩組流產(chǎn)絨毛染色體核型分析結果

2.3 胚胎性別與核型異常的關系698份流產(chǎn)絨毛樣本中男性胚胎占 48.14%（336／698），女性胚胎占51.86%（362／698），男女性別比例無顯著性差異（P＝0.164）。男性胚胎中染色體異常的胚胎占42.86%（144／336），女性胚胎中染色體異常的胚胎占45.30%（164／362），異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例無顯著性差異（P＝0.515，表 4）。

表4 胚胎性別與染色體核型異常的關系

3 討論

近年來，妊娠早期流產(chǎn)的發(fā)病率呈上升趨勢，是一種病因復雜的常見病。流產(chǎn)絨毛細胞染色體檢查有助于醫(yī)生了解胚胎細胞的遺傳特點，為查找流產(chǎn)病因提供理論依據(jù)。引發(fā)胚胎停育及早期流產(chǎn)的原因包括遺傳學因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素和環(huán)境因素等，排在第一的仍是染色體異常，異常率為50%～80%［4］。本研究的698例流產(chǎn)絨毛樣本中，檢出染色體非整倍體308例，異常率為44.12%。其中自然妊娠組的非整倍體發(fā)生率為43.73%，輔助生殖組的非整倍體發(fā)生率為46.08%。本研究中輔助生殖組女性平均年齡高于自然妊娠組，平均孕齡低于自然妊娠組，但自然妊娠組與輔助生殖組非整倍體發(fā)生率無顯著性差異。隨著女性年齡增加，不孕年限增加，接觸外部環(huán)境污染機會增多，出現(xiàn)減數(shù)分裂錯誤率增加，卵子質(zhì)量下降，胚胎非整倍體發(fā)生率增加［5］。而輔助生殖中男方精子數(shù)量、女方年齡、卵巢功能、用藥方案、子宮內(nèi)膜容受性及內(nèi)膜厚度是影響妊娠結局的重要因素，以上因素中很多也是染色體異常的高危因素，但輔助生殖是否使染色體異常的風險增加尚無定論［6-8］。

有文獻［9］報道引起自發(fā)流產(chǎn)最多的是16號三體，其次是21號三體和22號三體。本研究結果中16號三體最多72例，其次是22號三體34例和21號三體18例，與之前報道一致。此外，特納綜合征（45，X）病例大多數(shù)在胚胎期流產(chǎn)，只有少數(shù)可以存活，本研究共檢出33例，也是常見的異常核型。本研究也對各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中的差異進行了統(tǒng)計學分析，結果顯示均無顯著性差異。

本研究發(fā)現(xiàn)在早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中，女性胚胎的比例與男性胚胎相比，差異無統(tǒng)計學意義（51.86%vs 48.14%，P＞0.05），核型異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例差異也不顯著。但有文獻［10-11］報道早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中女性胚胎比例明顯高于男性，具體機制仍未知，可能是其他因素導致，也有可能是因為收集的樣本數(shù)量有限，后續(xù)可能需要更大的樣本量來證實。

綜上所述，胎兒的染色體異常是臨床上自然流產(chǎn)的主要誘因。如果能對流產(chǎn)的胚胎進行大規(guī)模的染色體非整倍體分析及相關的生化檢測，將有效地提高優(yōu)生優(yōu)育工作的效率。本研究采用的CNVplex技術探針分布廣，每條染色體設計5～8個探針，24條染色體共計170個探針，保證了染色體覆蓋的廣度和深度，使檢測結果更精準，其操作更簡便，快捷，通量高。該技術除可檢測24種染色體數(shù)目異常，還可檢測5Mb以上的缺失或重復，但CNVplex也存在一定局限性，例如無法檢測到流產(chǎn)絨毛染色體中嵌合體的比例，多倍體以及平衡易位、倒位等染色體結構異常。但這些異常情況在流產(chǎn)樣本中合計所占比例為10%～15%，可通過 CNVplex初篩后的其他成本高（如SNP-array）技術補充，以實現(xiàn)最高的檢測成本效能比。近年基因芯片技術和高通量測序技術也被用來進行流產(chǎn)絨毛染色體的檢測，這些新技術具有高準確性、高通量、高靈敏度等優(yōu)點，不僅能夠檢測染色體非整倍體，還能夠檢測精細拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV）［12-15］。 這些技術的聯(lián)合應用可以更為準確地診斷流產(chǎn)的遺傳病因，更加有利于臨床醫(yī)生快速尋找流產(chǎn)原因，指導下次備孕。