向菁菁,劉敏娟,毛 君,劉英華,張建林,張玉泉,李 紅,王 挺,李海波
(1南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心,江蘇 蘇州215002;2江蘇南通大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇 南通226000)
統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示只有25%~30%的妊娠能夠最終得到活產(chǎn),而其他70%~75%的妊娠終止在各個孕期,大部分是由于染色體異常。而對于懷孕前三個月的流產(chǎn),約50%是由于染色體異常導致[1]。因此,對早期停止發(fā)育的胚胎進行染色體檢查對指導再次生育具有重要的意義。輔助生殖技術(assisted reproduction technology,ART)指利用醫(yī)療技術對配子、合子、胚胎進行人工操作,以達到受孕的目的,包括宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination,IUI)和體外受精-胚胎移植技術(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)及其各種衍生技術。ART能夠有效治療不孕癥,在臨床上已經(jīng)得到廣泛應用,但由于高流產(chǎn)率,成功生育率仍然較低。為比較自然妊娠與輔助生殖技術妊娠早期流產(chǎn)胎兒的絨毛染色體非整倍體發(fā)生情況,本研究對自然妊娠和輔助生殖妊娠中698例早期流產(chǎn)絨毛運用CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測技術進行分析,比較兩組人群早孕期流產(chǎn)樣本染色體非整倍體情況,并進一步探討ART技術對胚胎非整倍體發(fā)生的影響。
CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測技術用于檢測染色體非整倍體,共設計有170對探針,分布在24條染色體的著絲粒兩側(cè)及染色體末端約0 Mb、10 Mb、20 Mb處進行探針設計,平均每條染色體覆蓋5~8條。該體系可用于檢測每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況,以及染色體的末端缺失或重復。2017年一篇關于CNVplex技術用于流產(chǎn)物檢測的文章中提到,CNVplex對于流產(chǎn)物的檢測結果與aCGH的結果完全一致,因此該技術可作為自然流產(chǎn)后有效的篩查方式[2]。 2017年國內(nèi)另一項研究[3]對 60例反復自然流產(chǎn)病例的絨毛樣本分別進行多重DNA拷貝數(shù)(CNVplex)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)技術檢測,所有樣本同時行絨毛培養(yǎng)核型分析驗證。結果48例培養(yǎng)成功的流產(chǎn)絨毛樣本中,染色體異常率為60.42%。其中48例CNV-plex檢測結果與核型分析相一致,而FISH檢測結果中與核型分析結果相符的只有38例。對于非嵌合體和非結構異常樣本,兩種方法與細胞遺傳學核型分析結果符合率分別為100%(CNVplex)和79.17%(FISH)[3]。本研究旨在通過具有更高成本效能比的檢測方法,對常規(guī)與輔助生殖流產(chǎn)的絨毛樣本檢測分析,以期揭示兩組在染色體異常方面的差異。
1.1 一般資料選擇2015年6月至2017年3月在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心門診就診,經(jīng)臨床確診為胚胎停止發(fā)育而行手術清宮的孕婦698例,年齡21~43歲,孕齡為5~15周。分成兩組:自然妊娠組和輔助生殖組,基本情況見表1,兩組年齡(P=0.000 04)和孕齡(P =0.002)比較,差異有統(tǒng)計學意義。
表1 兩組流產(chǎn)絨毛基本情況
1.2 方法
1.2.1 絨毛DNA的提取 挑取流產(chǎn)絨毛約15 mg,用Qiagen試劑盒提取DNA。DNA濃度和OD(260 nm)/OD(280 nm)比值用Nanodrop-1000測定,其 OD260/OD280 比值為 1.6~1.8,并將 DNA 稀釋至25 ng/μL。
1.2.2 CNVplex檢測及數(shù)據(jù)分析 采用天昊生物醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司N1008人類24條染色體非整倍體檢測試劑盒。試劑盒共設計了170對探針,保證每條染色體至少被5對探針覆蓋,這些探針在1個連接反應體系中完成連接,連接產(chǎn)物隨后進行PCR反應擴增,擴增產(chǎn)物進行熒光毛細管電泳分離[2]。具體實驗方法如下所述。①連接反應。每個反應孔中加入總量150 ng的相應體積的DNA樣本,并用滅菌純凈水補齊至8 μL,陰性對照直接加8 μL洗脫液。按說明書配制預混合液體系,混勻后每管分裝10.5 μL到反應孔中,置 PCR儀上進行如下反應:98℃ 2 min ;95℃ 30 s,60℃ 3 h 5 個循環(huán);60℃保存。連接反應共15 h,反應結束后加入20 μL“終止液”終止反應并混勻。②連接產(chǎn)物多重熒光PCR擴增。對連接探針產(chǎn)物,進行多重PCR擴增。按說明書配制預混合液體系:混勻后每管分裝19 μL,加入1 μL連接產(chǎn)物,置PCR儀上進行擴增:95℃ 2 min;94℃ 20s,62℃ -1℃ /cycle 40 s,72℃ 1.5 min 共 5 個循環(huán);94℃20 s,57℃ 40 s,72℃ 1.5 min 共 27 個循環(huán);68℃30 min;4℃保存。③擴增產(chǎn)物熒光毛細管電泳分離。取 1 μL 擴增產(chǎn)物稀釋液與 0.1 μL LIZ500,8.9 μL Hi-Di混勻后,95℃ 5 min變性后上ABI測序儀。④數(shù)據(jù)分析。目標峰高的數(shù)據(jù)由GeneMapper讀取,進而對樣本目的區(qū)域的拷貝數(shù)進行分析確定。
1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析處理,計數(shù)資料用率表示,兩組間的比較用t檢驗,卡方檢驗或Fisher精確檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況698份流產(chǎn)絨毛中非整倍體共計308例,異常率為44.12%(308/698)。自然妊娠組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為328例,非整倍體 255 例,異常率為 43.73%(255/583)。輔助生殖組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為62例,非整倍體53例,異常率為 46.08%(53/115)。 兩組異常率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.643,表 2)。
表2 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況
2.2 流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體的類型流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體中以三體型最為常見,占78.90%(243/308)。常染色體除了1號,19號三體未被檢出,其他染色體的三體都有檢測到,最常見的為16三體,22三體和21三體。特納綜合征(45,X)也是常見的異常核型(表3)。各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中無顯著性差異(表3)。
兩組流產(chǎn)絨毛染色體核型分析結果
2.3 胚胎性別與核型異常的關系698份流產(chǎn)絨毛樣本中男性胚胎占 48.14%(336/698),女性胚胎占51.86%(362/698),男女性別比例無顯著性差異(P=0.164)。男性胚胎中染色體異常的胚胎占42.86%(144/336),女性胚胎中染色體異常的胚胎占45.30%(164/362),異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例無顯著性差異(P=0.515,表 4)。
表4 胚胎性別與染色體核型異常的關系
近年來,妊娠早期流產(chǎn)的發(fā)病率呈上升趨勢,是一種病因復雜的常見病。流產(chǎn)絨毛細胞染色體檢查有助于醫(yī)生了解胚胎細胞的遺傳特點,為查找流產(chǎn)病因提供理論依據(jù)。引發(fā)胚胎停育及早期流產(chǎn)的原因包括遺傳學因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素和環(huán)境因素等,排在第一的仍是染色體異常,異常率為50%~80%[4]。本研究的698例流產(chǎn)絨毛樣本中,檢出染色體非整倍體308例,異常率為44.12%。其中自然妊娠組的非整倍體發(fā)生率為43.73%,輔助生殖組的非整倍體發(fā)生率為46.08%。本研究中輔助生殖組女性平均年齡高于自然妊娠組,平均孕齡低于自然妊娠組,但自然妊娠組與輔助生殖組非整倍體發(fā)生率無顯著性差異。隨著女性年齡增加,不孕年限增加,接觸外部環(huán)境污染機會增多,出現(xiàn)減數(shù)分裂錯誤率增加,卵子質(zhì)量下降,胚胎非整倍體發(fā)生率增加[5]。而輔助生殖中男方精子數(shù)量、女方年齡、卵巢功能、用藥方案、子宮內(nèi)膜容受性及內(nèi)膜厚度是影響妊娠結局的重要因素,以上因素中很多也是染色體異常的高危因素,但輔助生殖是否使染色體異常的風險增加尚無定論[6-8]。
有文獻[9]報道引起自發(fā)流產(chǎn)最多的是16號三體,其次是21號三體和22號三體。本研究結果中16號三體最多72例,其次是22號三體34例和21號三體18例,與之前報道一致。此外,特納綜合征(45,X)病例大多數(shù)在胚胎期流產(chǎn),只有少數(shù)可以存活,本研究共檢出33例,也是常見的異常核型。本研究也對各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中的差異進行了統(tǒng)計學分析,結果顯示均無顯著性差異。
本研究發(fā)現(xiàn)在早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中,女性胚胎的比例與男性胚胎相比,差異無統(tǒng)計學意義(51.86%vs 48.14%,P>0.05),核型異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例差異也不顯著。但有文獻[10-11]報道早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中女性胚胎比例明顯高于男性,具體機制仍未知,可能是其他因素導致,也有可能是因為收集的樣本數(shù)量有限,后續(xù)可能需要更大的樣本量來證實。
綜上所述,胎兒的染色體異常是臨床上自然流產(chǎn)的主要誘因。如果能對流產(chǎn)的胚胎進行大規(guī)模的染色體非整倍體分析及相關的生化檢測,將有效地提高優(yōu)生優(yōu)育工作的效率。本研究采用的CNVplex技術探針分布廣,每條染色體設計5~8個探針,24條染色體共計170個探針,保證了染色體覆蓋的廣度和深度,使檢測結果更精準,其操作更簡便,快捷,通量高。該技術除可檢測24種染色體數(shù)目異常,還可檢測5Mb以上的缺失或重復,但CNVplex也存在一定局限性,例如無法檢測到流產(chǎn)絨毛染色體中嵌合體的比例,多倍體以及平衡易位、倒位等染色體結構異常。但這些異常情況在流產(chǎn)樣本中合計所占比例為10%~15%,可通過 CNVplex初篩后的其他成本高(如SNP-array)技術補充,以實現(xiàn)最高的檢測成本效能比。近年基因芯片技術和高通量測序技術也被用來進行流產(chǎn)絨毛染色體的檢測,這些新技術具有高準確性、高通量、高靈敏度等優(yōu)點,不僅能夠檢測染色體非整倍體,還能夠檢測精細拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)[12-15]。 這些技術的聯(lián)合應用可以更為準確地診斷流產(chǎn)的遺傳病因,更加有利于臨床醫(yī)生快速尋找流產(chǎn)原因,指導下次備孕。