向菁菁，劉敏娟，毛 君，劉英華，張建林，張玉泉，李 紅，王 挺，李海波

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇 蘇州215002；2江蘇南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南通226000）

0 引言

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示只有25%～30%的妊娠能夠最終得到活產(chǎn)，而其他70%～75%的妊娠終止在各個(gè)孕期，大部分是由于染色體異常。而對(duì)于懷孕前三個(gè)月的流產(chǎn)，約50%是由于染色體異常導(dǎo)致［1］。因此，對(duì)早期停止發(fā)育的胚胎進(jìn)行染色體檢查對(duì)指導(dǎo)再次生育具有重要的意義。輔助生殖技術(shù)（assisted reproduction technology，ART）指利用醫(yī)療技術(shù)對(duì)配子、合子、胚胎進(jìn)行人工操作，以達(dá)到受孕的目的，包括宮腔內(nèi)人工授精（intrauterine insemination，IUI）和體外受精-胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）及其各種衍生技術(shù)。ART能夠有效治療不孕癥，在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但由于高流產(chǎn)率，成功生育率仍然較低。為比較自然妊娠與輔助生殖技術(shù)妊娠早期流產(chǎn)胎兒的絨毛染色體非整倍體發(fā)生情況，本研究對(duì)自然妊娠和輔助生殖妊娠中698例早期流產(chǎn)絨毛運(yùn)用CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析，比較兩組人群早孕期流產(chǎn)樣本染色體非整倍體情況，并進(jìn)一步探討ART技術(shù)對(duì)胚胎非整倍體發(fā)生的影響。

CNVplex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)用于檢測(cè)染色體非整倍體，共設(shè)計(jì)有170對(duì)探針，分布在24條染色體的著絲粒兩側(cè)及染色體末端約0 Mb、10 Mb、20 Mb處進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，平均每條染色體覆蓋5～8條。該體系可用于檢測(cè)每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況，以及染色體的末端缺失或重復(fù)。2017年一篇關(guān)于CNVplex技術(shù)用于流產(chǎn)物檢測(cè)的文章中提到，CNVplex對(duì)于流產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果與aCGH的結(jié)果完全一致，因此該技術(shù)可作為自然流產(chǎn)后有效的篩查方式［2］。 2017年國(guó)內(nèi)另一項(xiàng)研究［3］對(duì) 60例反復(fù)自然流產(chǎn)病例的絨毛樣本分別進(jìn)行多重DNA拷貝數(shù)（CNVplex）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)，所有樣本同時(shí)行絨毛培養(yǎng)核型分析驗(yàn)證。結(jié)果48例培養(yǎng)成功的流產(chǎn)絨毛樣本中，染色體異常率為60.42%。其中48例CNV-plex檢測(cè)結(jié)果與核型分析相一致，而FISH檢測(cè)結(jié)果中與核型分析結(jié)果相符的只有38例。對(duì)于非嵌合體和非結(jié)構(gòu)異常樣本，兩種方法與細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析結(jié)果符合率分別為100%（CNVplex）和79.17%（FISH）［3］。本研究旨在通過(guò)具有更高成本效能比的檢測(cè)方法，對(duì)常規(guī)與輔助生殖流產(chǎn)的絨毛樣本檢測(cè)分析，以期揭示兩組在染色體異常方面的差異。

1 資料和方法

1.1 一般資料選擇2015年6月至2017年3月在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心門診就診，經(jīng)臨床確診為胚胎停止發(fā)育而行手術(shù)清宮的孕婦698例，年齡21～43歲，孕齡為5～15周。分成兩組：自然妊娠組和輔助生殖組，基本情況見(jiàn)表1，兩組年齡（P＝0.000 04）和孕齡（P ＝0.002）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組流產(chǎn)絨毛基本情況

1.2 方法

1.2.1 絨毛DNA的提取 挑取流產(chǎn)絨毛約15 mg，用Qiagen試劑盒提取DNA。DNA濃度和OD（260 nm）／OD（280 nm）比值用Nanodrop-1000測(cè)定，其 OD260／OD280 比值為 1.6～1.8，并將 DNA 稀釋至25 ng／μL。

1.2.2 CNVplex檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 采用天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司N1008人類24條染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒。試劑盒共設(shè)計(jì)了170對(duì)探針，保證每條染色體至少被5對(duì)探針覆蓋，這些探針在1個(gè)連接反應(yīng)體系中完成連接，連接產(chǎn)物隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳分離［2］。具體實(shí)驗(yàn)方法如下所述。①連接反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)孔中加入總量150 ng的相應(yīng)體積的DNA樣本，并用滅菌純凈水補(bǔ)齊至8 μL，陰性對(duì)照直接加8 μL洗脫液。按說(shuō)明書(shū)配制預(yù)混合液體系，混勻后每管分裝10.5 μL到反應(yīng)孔中，置 PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：98℃ 2 min ；95℃ 30 s，60℃ 3 h 5 個(gè)循環(huán)；60℃保存。連接反應(yīng)共15 h，反應(yīng)結(jié)束后加入20 μL“終止液”終止反應(yīng)并混勻。②連接產(chǎn)物多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增。對(duì)連接探針產(chǎn)物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。按說(shuō)明書(shū)配制預(yù)混合液體系：混勻后每管分裝19 μL，加入1 μL連接產(chǎn)物，置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 2 min；94℃ 20s，62℃ -1℃ ／cycle 40 s，72℃ 1.5 min 共 5 個(gè)循環(huán)；94℃20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min 共 27 個(gè)循環(huán)；68℃30 min；4℃保存。③擴(kuò)增產(chǎn)物熒光毛細(xì)管電泳分離。取 1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液與 0.1 μL LIZ500，8.9 μL Hi-Di混勻后，95℃ 5 min變性后上ABI測(cè)序儀。④數(shù)據(jù)分析。目標(biāo)峰高的數(shù)據(jù)由GeneMapper讀取，進(jìn)而對(duì)樣本目的區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間的比較用t檢驗(yàn)，卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況698份流產(chǎn)絨毛中非整倍體共計(jì)308例，異常率為44.12%（308／698）。自然妊娠組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為328例，非整倍體 255 例，異常率為 43.73%（255／583）。輔助生殖組流產(chǎn)絨毛正常整倍體為62例，非整倍體53例，異常率為 46.08%（53／115）。 兩組異常率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.643，表 2）。

表2 兩組流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體情況

2.2 流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體的類型流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體中以三體型最為常見(jiàn)，占78.90%（243／308）。常染色體除了1號(hào)，19號(hào)三體未被檢出，其他染色體的三體都有檢測(cè)到，最常見(jiàn)的為16三體，22三體和21三體。特納綜合征（45，X）也是常見(jiàn)的異常核型（表3）。各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中無(wú)顯著性差異（表3）。

兩組流產(chǎn)絨毛染色體核型分析結(jié)果

2.3 胚胎性別與核型異常的關(guān)系698份流產(chǎn)絨毛樣本中男性胚胎占 48.14%（336／698），女性胚胎占51.86%（362／698），男女性別比例無(wú)顯著性差異（P＝0.164）。男性胚胎中染色體異常的胚胎占42.86%（144／336），女性胚胎中染色體異常的胚胎占45.30%（164／362），異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例無(wú)顯著性差異（P＝0.515，表 4）。

表4 胚胎性別與染色體核型異常的關(guān)系

3 討論

近年來(lái)，妊娠早期流產(chǎn)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是一種病因復(fù)雜的常見(jiàn)病。流產(chǎn)絨毛細(xì)胞染色體檢查有助于醫(yī)生了解胚胎細(xì)胞的遺傳特點(diǎn)，為查找流產(chǎn)病因提供理論依據(jù)。引發(fā)胚胎停育及早期流產(chǎn)的原因包括遺傳學(xué)因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素和環(huán)境因素等，排在第一的仍是染色體異常，異常率為50%～80%［4］。本研究的698例流產(chǎn)絨毛樣本中，檢出染色體非整倍體308例，異常率為44.12%。其中自然妊娠組的非整倍體發(fā)生率為43.73%，輔助生殖組的非整倍體發(fā)生率為46.08%。本研究中輔助生殖組女性平均年齡高于自然妊娠組，平均孕齡低于自然妊娠組，但自然妊娠組與輔助生殖組非整倍體發(fā)生率無(wú)顯著性差異。隨著女性年齡增加，不孕年限增加，接觸外部環(huán)境污染機(jī)會(huì)增多，出現(xiàn)減數(shù)分裂錯(cuò)誤率增加，卵子質(zhì)量下降，胚胎非整倍體發(fā)生率增加［5］。而輔助生殖中男方精子數(shù)量、女方年齡、卵巢功能、用藥方案、子宮內(nèi)膜容受性及內(nèi)膜厚度是影響妊娠結(jié)局的重要因素，以上因素中很多也是染色體異常的高危因素，但輔助生殖是否使染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)增加尚無(wú)定論［6-8］。

有文獻(xiàn)［9］報(bào)道引起自發(fā)流產(chǎn)最多的是16號(hào)三體，其次是21號(hào)三體和22號(hào)三體。本研究結(jié)果中16號(hào)三體最多72例，其次是22號(hào)三體34例和21號(hào)三體18例，與之前報(bào)道一致。此外，特納綜合征（45，X）病例大多數(shù)在胚胎期流產(chǎn)，只有少數(shù)可以存活，本研究共檢出33例，也是常見(jiàn)的異常核型。本研究也對(duì)各種非整倍體類型的比例在兩組流產(chǎn)絨毛中的差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示均無(wú)顯著性差異。

本研究發(fā)現(xiàn)在早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中，女性胚胎的比例與男性胚胎相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（51.86%vs 48.14%，P＞0.05），核型異常胚胎在兩種性別胚胎中的比例差異也不顯著。但有文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道早期流產(chǎn)的胎兒絨毛組織樣本中女性胚胎比例明顯高于男性，具體機(jī)制仍未知，可能是其他因素導(dǎo)致，也有可能是因?yàn)槭占臉颖緮?shù)量有限，后續(xù)可能需要更大的樣本量來(lái)證實(shí)。

綜上所述，胎兒的染色體異常是臨床上自然流產(chǎn)的主要誘因。如果能對(duì)流產(chǎn)的胚胎進(jìn)行大規(guī)模的染色體非整倍體分析及相關(guān)的生化檢測(cè)，將有效地提高優(yōu)生優(yōu)育工作的效率。本研究采用的CNVplex技術(shù)探針?lè)植紡V，每條染色體設(shè)計(jì)5～8個(gè)探針，24條染色體共計(jì)170個(gè)探針，保證了染色體覆蓋的廣度和深度，使檢測(cè)結(jié)果更精準(zhǔn)，其操作更簡(jiǎn)便，快捷，通量高。該技術(shù)除可檢測(cè)24種染色體數(shù)目異常，還可檢測(cè)5Mb以上的缺失或重復(fù)，但CNVplex也存在一定局限性，例如無(wú)法檢測(cè)到流產(chǎn)絨毛染色體中嵌合體的比例，多倍體以及平衡易位、倒位等染色體結(jié)構(gòu)異常。但這些異常情況在流產(chǎn)樣本中合計(jì)所占比例為10%～15%，可通過(guò) CNVplex初篩后的其他成本高（如SNP-array）技術(shù)補(bǔ)充，以實(shí)現(xiàn)最高的檢測(cè)成本效能比。近年基因芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)也被用來(lái)進(jìn)行流產(chǎn)絨毛染色體的檢測(cè)，這些新技術(shù)具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠檢測(cè)染色體非整倍體，還能夠檢測(cè)精細(xì)拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV）［12-15］。 這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可以更為準(zhǔn)確地診斷流產(chǎn)的遺傳病因，更加有利于臨床醫(yī)生快速尋找流產(chǎn)原因，指導(dǎo)下次備孕。