蔣惠莉

（青海省西寧市第一人民醫(yī)院檢驗科 青海 西寧 810000）

基因擴增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中非常重要的實驗方法。近年來發(fā)展迅速，從最初采用凝膠電泳法對擴增產(chǎn)物進行定性或半定量分析[1]，到目前廣泛使用的根據(jù)熒光探針信號實時觀察和已知標準品來推算未知樣本拷貝量的實時熒光定量PCR法(qPCR)[2]，現(xiàn)在已發(fā)展到可以對核酸的拷貝數(shù)進行絕對定量的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)。數(shù)字PCR不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值（CT）和標準曲線等參數(shù)，與常規(guī)定量PCR技術(shù)相比，具有更高的重復(fù)性、靈敏性及準確性[3-5]。本文主要從dPCR方法的原理，優(yōu)勢及其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面進行了闡述。

1.數(shù)字PCR基本原理

1999年，美國學(xué)者Kenneth Kinzler與Bert Vogelstein首次提出了“數(shù)字 PCR”的概念[6]。dPCR的基本原理大致分為三個步驟，第一步將PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)單元中，使每個微反應(yīng)單元中不包含或包含一個或多個拷貝的目標分子，其目的是為了實行單分子模板擴增。第二步，進行擴增反應(yīng)，擴增結(jié)束后檢測每個反應(yīng)單元熒光信號的有無。第三步，最終根據(jù)泊松分布原理，通過統(tǒng)計分析陽性反應(yīng)單元的個數(shù)與比例，計算出目的核酸序列的拷貝數(shù)[7]。根據(jù)對反應(yīng)體系的分配方式不同，數(shù)字PCR主要分為微流體芯片式數(shù)字PCR(cdPCR )和微滴式數(shù)字PCR(ddPCR )兩大類[7]。

2.數(shù)字PCR的優(yōu)勢

2.1 絕對定量

dPCR采用終點熒光檢測和陽性反應(yīng)單元比例進行定量分析，與qPCR相比較不需要標準品，也不需制作標準曲線，實現(xiàn)真正意義上的絕對定量[1]。

2.2 抑制劑耐受性強

dPCR在反應(yīng)體系分配的過程中，不僅使目的序列分配到每個反應(yīng)單元，同時其反應(yīng)抑制物也被被均勻分配到每個反應(yīng)單元，從而降低了抑制劑對反應(yīng)的干擾。所以，dPCR較適合檢測復(fù)雜樣品中核酸的絕對定量。

2.3 高靈敏度和高精準度

dPCR是將PCR反應(yīng)分割在數(shù)萬個獨立單元中進行降低了抑制物影響，從而提高了檢測的靈敏度，可以精確地檢測出變化很小的目的序列。并且分割的獨立反應(yīng)單元數(shù)目越多，其靈敏度與準確度也越高[2]。

3.數(shù)字PCR在臨床中的應(yīng)用

3.1 癌癥早期發(fā)現(xiàn)與診斷

隨著對癌癥的不斷認識，大量研究表明癌癥是由于癌基因及抑癌基因的突變、插入或缺失等的一種基因（染色體）異常變化引起的疾病[8]。篩查患者外周血中游離的循環(huán)腫瘤DNA（cell-free circulating tumor DNA，ctDNA），對發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，及腫瘤的發(fā)展及復(fù)發(fā)進行觀測有著重要的意義[9]。不過，循環(huán)腫瘤DNA含量低，通常與大量正常細胞同時存在，對檢測手段的靈敏度及抗干擾有著更高的要求。數(shù)字PCR的檢測靈敏度可達到0.0001%～0.001%[10]，特別適合在復(fù)雜樣本中檢測稀有突變。Kinugasa H等學(xué)者利用dPCR技術(shù)對75例胰腺癌患者血清K-ras基因突變進行分析，并將其結(jié)果與生存率進行比較，ctDNA分析可作為檢測胰腺癌患者基因突變的一種非侵入性檢測方法，也可作為診斷胰腺癌和預(yù)測生存的新策略[11]。

3.2 產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷是優(yōu)生和預(yù)防缺陷兒的出生的非常重要的手段,通過羊水及母血清篩檢胎兒遺傳物質(zhì)是否有異常是目前產(chǎn)前篩查較長用的方法，尤其是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷能夠更早、更快、更安全的進行產(chǎn)前診斷。然而,胎兒游離DNA在母體血漿DNA占10%～20%[12]，極低含量的胎兒游離 DNA混雜于大量母體DNA中[7]，選擇合適的方法學(xué)尤為重要。dPCR可從高背景母體DNA中識別少量胎兒DNA分子，在介入性產(chǎn)前診斷及無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷胎兒非整倍體疾病、單基因病等方面都具有重要作用[13]，而且能夠檢測到存在的嵌合體或污染母體DNA的信號[14]。Tsui NB等利用dPCR技術(shù)研究胎兒血友病突變基因，在12例樣本中準確識別出7個具有突變基因的胎兒[15]。

3.3 病原微生物分子診斷

目前，對病原微生物核酸的檢測，應(yīng)用于臨床多為實時熒光定量PCR，定量檢測需要依賴標準曲線的建立，不同廠家及不同批次的標準品均有可能影響定量結(jié)果。數(shù)字PCR結(jié)果分析不需要標準曲線，結(jié)果重復(fù)性較好，并且其高靈敏的特點更加適用于對低拷貝的目的基因檢測。Sedlak RH等進行了人類巨細胞病毒對造血細胞或器官移植患者的發(fā)病和死亡的研究，發(fā)現(xiàn)dPCR技術(shù)能夠更早的檢測到患者外周血中的巨細胞病毒，從而能盡早治療，減低移植失敗率[16]。

3.4 器官移植

患者接受器官移植后自身免疫系統(tǒng)可能把移植器官當做異物，引起排異反應(yīng)。傳統(tǒng)監(jiān)測指標多數(shù)為檢測患者血液中各類蛋白、酶類、代謝物等濃度水平，其不能及時的評估早期器官移植的損傷[17]。由于器官移植也是基因組移植，對移植器官的游離DNA(graft-derived circulating cell-free DNA，GcfDNA)進行監(jiān)測，可早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，從而早期干預(yù)，改善移植患者的預(yù)后[17][18]。數(shù)字PCR可以快速地量化GcfDNA的百分比和絕對數(shù)量，這個過程不需要供體DNA，因此可以應(yīng)用于任何器官捐贈者/受體對[17]。Schutz E等學(xué)者，使用液滴數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)對115名肝移植患者血漿GcfDNA進行監(jiān)測，研究結(jié)果表明GcfDNA的診斷敏感性和特異性分別為90.3%和92.9%，與傳統(tǒng)的常規(guī)肝功能檢查相比，在肝移植患者中對急性排斥反應(yīng)更為敏感[19]。Beck等研究者使用dPCR檢測GcfDNA，檢測出穩(wěn)定肝移植患者體內(nèi)GcfDNA的含量小于6.8%，穩(wěn)定腎移植患者小于2.5%,心移植小于3.4%[7][20]。

4.結(jié)語

數(shù)字PCR的出現(xiàn)為分子生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域提供了新的實驗方法，其應(yīng)用也越來越廣泛。但是，目前數(shù)字PCR由于每塊芯片的數(shù)萬個反應(yīng)單元都是對單一樣本分析，通量較低，故實驗成本高[2]。另外，dPCR對較高濃度樣本檢測時，當數(shù)萬個檢測單元達到飽和，其絕對定量結(jié)果就不十分精準。隨著對實驗方法的不斷研究，dPCR技術(shù)會進一步發(fā)展與完善，將有著更加廣闊的應(yīng)用前景。

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