孫安南

摘 要：花藥是被子植物產(chǎn)生雄性配子體的重要生殖器官，它的正常發(fā)育對(duì)植物的繁衍和傳代非常重要。而植物生長(zhǎng)發(fā)育的每一個(gè)階段，從種子萌發(fā)到開花結(jié)果，都受到體內(nèi)激素的調(diào)控。目前，包括生長(zhǎng)素在內(nèi)的六大植物激素及其相應(yīng)的信號(hào)調(diào)控通路參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的功能和機(jī)制研究已經(jīng)被廣泛報(bào)道。其中，蕓苔素（brassinosteroids， BRs）是植物中一種促進(jìn)生長(zhǎng)的甾體激素，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的相關(guān)遺傳學(xué)研究奠定了BR在植物發(fā)育過程中的重要地位，BR合成以及信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)基因也被報(bào)道在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、葉片發(fā)育、開花、光形態(tài)建成以及雄性生殖等過程中發(fā)揮重要作用。目前，這些基因參與調(diào)控花藥發(fā)育背后的具體機(jī)制尚不清晰。我們通過運(yùn)用mRNA原位雜交的方法分析了蕓苔素信號(hào)通路中編碼了轉(zhuǎn)錄因子的重要基因BZR1在擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的花藥中的表達(dá)模式，為BR信號(hào)通路調(diào)控雄蕊發(fā)育的機(jī)制研究提供了新的認(rèn)識(shí)和重要的參考。

關(guān)鍵詞：擬南芥；花藥；蕓苔素；BZR1；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）23-0199-04

雄性生殖在開花植物繁衍傳代的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量有重要的影響。雄性不育是指植物體中雄蕊發(fā)育由于受到內(nèi)、 外因素的影響而發(fā)育不正常的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。研究植物雄性生殖器官花藥的正常發(fā)育過程以及揭示參與調(diào)控這一過程的重要基因的功能，對(duì)于我們通過遺傳改良來增加糧食等作物的產(chǎn)量由重要的意義。

擬南芥植株小且產(chǎn)生的種子多，非常適合作為模式植物來進(jìn)行遺傳學(xué)研究。擬南芥是十字花科植物，擁有六個(gè)雄蕊，四長(zhǎng)兩短，四個(gè)較長(zhǎng)的雄蕊被稱為四強(qiáng)雄蕊。雄蕊由花絲和花藥兩部分組成。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，前人將擬南芥花藥的發(fā)育過程總共分成14個(gè)階段：發(fā)育到第5期時(shí)，具有四角結(jié)構(gòu)的花藥原基孢子體細(xì)胞開始分化形成了由表皮層、內(nèi)皮層、中間層、絨氈層，這四層體細(xì)胞包圍小孢子母細(xì)胞形成了花藥的典型的蝴蝶狀結(jié)構(gòu)。第6-7期，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體小孢子的四分體，四分體被胼胝質(zhì)層包裹。花藥發(fā)育進(jìn)入第8期時(shí)，胼胝質(zhì)酶復(fù)合體降解了胼胝質(zhì)層，小孢子從四分體中釋放出來，孢粉素等物質(zhì)隨著絨氈層的降解，積聚到花粉母細(xì)胞表面，慢慢形成花粉壁。在第9到12期，經(jīng)過兩次有絲分裂，三核的花粉粒形成；此后，花藥開裂，成熟花粉釋放。

在擬南芥中，絨氈層是一層特殊的細(xì)胞層，該類細(xì)胞內(nèi)含較多的RNA和蛋白質(zhì)，并有油脂和類胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為花粉粒發(fā)育提供了所需養(yǎng)料和信號(hào)分子。在花藥的正常的發(fā)育中，絨氈層細(xì)胞分裂、分化成體細(xì)胞層，包圍花粉母細(xì)胞（PMCs），絨氈層細(xì)胞的形成對(duì)成熟花粉的形成和釋放有直接的作用，因此直接決定了雄蕊的育性，進(jìn)而影響植株的雄性育性。在花藥發(fā)育的第5期，各層細(xì)胞命運(yùn)決定后，絨氈層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與其他孢子體細(xì)胞并沒有明顯的差異。而在減數(shù)分裂期間，絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)則變得濃密，其中充滿了核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等等，顯示其代謝高度活躍。減數(shù)分裂完成后，小孢子外的胼胝質(zhì)在絨氈層分泌的胼胝質(zhì)酶作用下降解，小孢子從四分體中釋放出來并開始發(fā)育成熟，而絨氈層進(jìn)一步特化為海綿狀的細(xì)胞，分泌小泡釋放小孢子發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)、脂類及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在花粉第一次有絲分裂完成 時(shí)，絨氈層細(xì)胞開始降解，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞殘余與脂體釋放到花粉表面成為對(duì)花粉粘著和信號(hào)識(shí)別很重要的花粉包被。

近些年國(guó)內(nèi)外以擬南芥為材料，在花藥發(fā)育過程中的分子調(diào)控機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)雄性不育的突變體并克隆了相關(guān)基因，包括重要的轉(zhuǎn)錄因子如：DYT1、AMS和TDF1。DYT1在花藥發(fā)育的第5期和第6期有較高的特異表達(dá)，dyt1突變體絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)提前的異?？张莼蛩幨覂?nèi)部擠壓且無法順利降解，生殖細(xì)胞不能發(fā)育形成成熟花粉粒。TDF1編碼一個(gè)在絨氈層、減數(shù)分裂細(xì)胞以及小孢子細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，TDF1突變后，突變體花藥的絨氈層細(xì)胞無法進(jìn)一步分化并分泌胼胝質(zhì)酶，從而導(dǎo)致小孢子母細(xì)胞的提前降解。AMS編碼了對(duì)于花藥絨氈層與減數(shù)分裂后小孢子發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在ams突變體中，絨氈層細(xì)胞在四分體被釋放后出現(xiàn)空泡化，小孢子在四分體時(shí)期后逐漸降解。

蕓苔素最早由Michelle于1970年發(fā)現(xiàn)，他從油菜（Brassica napus）花粉中提取出了一種能促進(jìn)植物莖桿伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的高活性物質(zhì)，將其稱為蕓苔素（brassinolide，BL），蕓苔素可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，此后，具有與BL相似結(jié)構(gòu)和活性的甾體分子不斷被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為蕓苔素甾醇（brassinosteroids，BRs）。隨后，在擬南芥中，大量BR 相關(guān)的突變體被發(fā)現(xiàn)，BR在發(fā)育中的功能也逐漸清晰。目前，我們已經(jīng)研究證明了BR信號(hào)通路相關(guān)的基因參與調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、葉片發(fā)育、開花、光形態(tài)建成以及雄性生殖過程。BR被認(rèn)為是廣泛調(diào)控如細(xì)胞伸長(zhǎng)、維管分化、根生長(zhǎng)、對(duì)光的反應(yīng)、抗逆、衰老等發(fā)育過程和生理過程的基本激素之一。這些基因除了編碼了受體蛋白激酶的BR INSENSITIVE 1（BRI1）、編碼擬南芥糖原合酶激酶3（GSK3）樣激酶的BR INSENSITIVE 2（BIN2）等外，還包括編碼轉(zhuǎn)錄因子的BZR1（BRASSINAZOLE RESISTANT 1）等。進(jìn)一步的生物化學(xué)研究將這些組分整合起來，形成了一條連接從BR在細(xì)胞表面的感知到細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子激活的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即BR信號(hào)通路。

BR影響植物雄性育性，而BZR1是BR調(diào)控下游基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，但目前并未有BZR1在花藥發(fā)育過程中所發(fā)揮功能的研究報(bào)道。要了解基因功能，首先我們需要從目的基因的表達(dá)水平和模式研究入手，原位雜交（In situ Hybridization）是一種從細(xì)胞學(xué)角度研究基因表達(dá)水平和模式的有效的分子生物學(xué)技術(shù)，用原位雜交技術(shù)來探討植物基因的時(shí)空表達(dá)研究是一種重要且成熟的研究手段。因此確定BZR1基因在不同發(fā)育時(shí)期的花藥中的表達(dá)模式，可以為我們進(jìn)一步了解BZR1在花藥中可能發(fā)揮的分子功能提供線索，從而為從遺傳上提高植物育性、增加作物產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)，無疑是必要且具創(chuàng)新性的。endprint

1 材料與方法

1.1 植物材料和植物培養(yǎng)

本研究所用到的擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（Col-0）植株材料為哥倫比亞（Columbia）生態(tài)型背景。擬南芥植物種子點(diǎn)播在PH值為5.8的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃處理48h后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱（16h光照8h黑暗），7天后將幼苗移栽至培養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)，溫室的生長(zhǎng)條件為：22攝氏度、濕度為65%、光周期為16h/8h（光/暗）。

1.2 植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

首先取擬南芥花序，放入在1.5ml的離心管中，用液氮冷凍后研磨，待細(xì)胞組織破碎后加入1mL的Trizol試劑，劇烈震蕩15秒，在室溫靜置15分鐘。隨后再加入200微升的氯仿，震蕩混勻后靜置2分鐘，在4攝氏度以12000g轉(zhuǎn)速離心15分鐘，移取上層清液，轉(zhuǎn)入新的1.5毫升的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，在-20攝氏度沉淀1小時(shí)。4攝氏度低溫12000g 離心15分鐘，棄上清，加入1mL 75%的乙醇清洗沉淀。7000g轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上清溶液后開蓋風(fēng)干，加入適當(dāng)體積的RNase-free水溶解RNA。

測(cè)量所提RNA溶液A260nm、A280nm吸光值，計(jì)算A260nm/A280nm以衡量總RNA純度。

使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。先使用gDNA Eraser酶在42攝氏度下消除所提RNA中混雜的基因組DNA。隨后使用反轉(zhuǎn)錄酶于37攝氏度將RAN反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 原位雜交探針的制備

在NCBI網(wǎng)站上搜索BZR1基因的cDNA序列，找到特異性高的序列區(qū)段（400bp）左右，針對(duì)這一序列設(shè)計(jì)探針引物。然后以擬南芥花序cDNA為模板，擴(kuò)增探針序列，用T4連接酶連接至pGEM-T載體（Promega公司），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用氨芐抗性平板篩選陽性克隆，提質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確者進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)粒酶切（分別用Apa1酶和Spe1酶進(jìn)行單酶切），酶切產(chǎn)物用SP6及T7轉(zhuǎn)錄酶分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的RNA產(chǎn)物經(jīng)過純化后即為反義及正義探針。

1.4 石蠟切片的制備

用RNase Free的FAA固定液對(duì)Col-0花序進(jìn)行固定，講過低溫抽真空后，花序材料完全浸透于固定液中，換新鮮的FAA固定液后4攝氏度低溫靜置過夜。用50%、60%、70%、80%、90%、95%及100%的梯度濃度的酒精進(jìn)行材料脫水處理，再用25%、50%、75%及100%的二甲苯梯度濃度溶液進(jìn)行透明化處理，逐步加入蠟片，直至材料完全置入100%純蠟中。包埋蠟塊，并用石蠟切片機(jī)進(jìn)行花序組織的切片。

1.5 原位雜交實(shí)驗(yàn)

對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟覆水，在37攝氏度條件下用蛋白酶K對(duì)切片上的花序細(xì)胞組織的骨架蛋白進(jìn)行消化，經(jīng)過逐級(jí)脫水后每張片子加探針（50%甲酰胺，300mmoL/L NaCl，10mmoL/L Tris，1mmoL/L EDTA，1% Blocking Reagent），42攝氏度雜交過夜，次日依次用2×SSC溶液、0.5×SSC溶液、0.2×SSC溶液洗片，RNase消化30min，0.2×SSC溶液、PBS洗片，Blocking Reagent封閉1h，BSA封閉1h，抗-DIG-AP偶聯(lián)二抗2h，NBT-BCIP顯色，光鏡下待顯色程度合適后中止反應(yīng)，封片觀察，拍片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BZR1基因探針序列PCR

我們以擬南芥花序cDNA為模板，用正向引物（TCTAAGAACCCGAAACCGTT）和反向引物（TGTATCCTCTCTCCTTCCCAG）來對(duì)BZR1基因的特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳（圖1），以Trans 2k plus（全式金公司）DNA marker為指示，可見大小為600bp左右，與目的片段大小一致。

2.2 轉(zhuǎn)錄探針的檢測(cè)

用Roche公司的DIG轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行BZR1基因的探針轉(zhuǎn)錄，正反義探針經(jīng)過電泳檢測(cè)，均顯示出明亮的RNA條帶（圖2），證明探針合成過程正常，可用于原位雜交實(shí)驗(yàn)。

2.3 BZR1基因在花藥絨氈層及花粉母細(xì)胞中特異表達(dá)

為了進(jìn)一步明確BZR1基因在花藥發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)模式，本研究通過原位雜交的方法檢測(cè)了該基因在花藥4-12期的表達(dá)模式。

結(jié)果如圖3所示。

BZR1基因從花藥第5期開始在花粉母細(xì)胞和絨氈層中表達(dá)，信號(hào)持續(xù)至第8期開始減弱，隨著絨氈層的降解，信號(hào)逐漸減弱，最后完全消失。BZR1在花藥絨氈層及孢子母細(xì)胞中的表達(dá)模式暗示了其可能在花藥發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

原位雜交的結(jié)果顯示BZR1基因在花藥細(xì)胞中有表達(dá)，說明BZR1在其發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的作用。BZR1基因表現(xiàn)出了較高的表達(dá)豐度，在花藥發(fā)育中、晚期（5-9期）顯示了一定的表達(dá)水平，且主要在絨氈層細(xì)胞中表達(dá)。絨氈層細(xì)胞對(duì)花藥的發(fā)育至關(guān)重要，因此我們可以推測(cè)BZR1基因可能主要通過參與調(diào)控花藥絨氈層細(xì)胞的發(fā)育來發(fā)揮其在雄性生殖方面的功能。

生命個(gè)體的遺傳信息經(jīng)歷從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，再進(jìn)一步翻譯成各種功能蛋白的過程，最后執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能。僅mRNA水平的表達(dá)分析無法反映基因在翻譯水平的情況，因此，想要更多地了解BZR1基因參與雄性生殖過程的調(diào)控機(jī)制，在本研究的成果，還需要進(jìn)行更為深入的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及功能分析。

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