秦曉飛,張勇勇,陳文吉,韓 志
骨肉瘤是全球青少年最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤,由于轉(zhuǎn)移和化療抵抗,骨肉瘤患者預后較差。廣泛的腫瘤切除,新輔助放、化療使骨肉瘤患者存活率有顯著改善,但5年生存率仍保持15%~30%[1]。尋找判斷腫瘤的預后或?qū)εR床治療具有指導意義的分子標記并進行選擇性靶向治療,對提高骨肉瘤治療的效果有重要意義。兩者作為肺癌、乳腺癌、胃癌等靶向治療的靶點及化療耐藥相關(guān)的基因得到廣泛深入的研究,并已應用于臨床。本文檢測骨肉瘤中EGFR、HER-2的表達,分析EGFR、HER-2在骨肉瘤中的作用及其與臨床病理特征的關(guān)系,旨在為骨肉瘤的治療提供新思路。
1.1臨床資料收集2009年1月~2016年12月河南省洛陽正骨醫(yī)院收治的骨肉瘤45例,其中男性27例,女性18例,年齡10~64歲,平均28歲,中位年齡20.5歲,病程15天~18個月;組織學類型:低級別骨肉瘤8例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例、皮質(zhì)旁骨肉瘤3例),普通型骨肉瘤37例。入組標準:(1)經(jīng)術(shù)前病理穿刺確診為骨肉瘤;(2)穿刺前未經(jīng)放、化療及藥物治療;(3)在我院擬采取新輔助化療后手術(shù)治療。排除標準:(1)合并有除骨肉瘤以外的其他惡性腫瘤;(2)合并嚴重的心肝腎等系統(tǒng)性疾病。本實驗獲醫(yī)院倫理委員會審核,患者均知情同意。另收集37例骨肉瘤患者腫瘤周圍正常骨組織作為對照。
1.2試劑兔抗人單克隆抗體EGFR、HER-2及EnVision法檢測試劑盒均購自福州邁新公司。
1.3方法活檢的腫瘤組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,包埋石蠟,4 μm厚連續(xù)切片,脫蠟水化;磷酸鹽緩沖液沖洗,滴加EGFR、HER-2一抗,4 ℃過夜;磷酸緩沖液沖洗,滴加二抗,37 ℃孵育20 min;磷酸緩沖液沖洗,DAB顯色;自來水充分沖洗,復染,脫水透明,封固。
1.4結(jié)果判斷EGFR陽性表達于胞膜或胞質(zhì),HER-2陽性表達于胞膜,陽性信號均為淡黃色至棕褐色。結(jié)果判讀采用半定量計分法,即染色強度結(jié)合陽性腫瘤細胞百分比綜合評分。按染色強度標準計分:細胞弱著色,即陽性信號在400倍視野下可見但在低倍視野下不清晰為1分;細胞中度著色,即陽性信號在40倍視野下清晰可見為2分;細胞強著色,即陽性信號在40倍視野下清晰可見為3分。按陽性細胞百分比標準計分:≤5%為0分;6%~25%為1分;26%~50%為2分;>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘:0分為不表達;1~2分為弱表達;3~6分為中度表達;7~9分為強表達。將不表達和弱表達定義為陰性,中度表達和強表達定義為陽性。
1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。陽性率比較采用χ2檢驗,應用Spearman相關(guān)分析。
2.1EGFR在骨肉瘤中的表達45例患者骨肉瘤組織中EGFR陽性34例(75.6%),其中24例強陽性(圖1),11例陰性(24.4%)。腫瘤周圍正常骨組織中未見EGFR表達。骨肉瘤組織中EGFR蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。
2.2HER-2在骨肉瘤中的表達45例患者骨肉瘤組織HER-2陽性9例(20%)(圖2),陰性36例(80%),未見有強陽性。腫瘤周圍正常骨組織中未見HER-2表達。骨肉瘤組織中HER-2蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。
①②
圖1EGFR在骨肉瘤組織中的表達,EnVision法圖2HER-2在骨肉瘤組織中的表達,EnVision法
2.3EGFR、HER-2表達與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系EGFR、HER-2表達與骨肉瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P均>0.05);EGFR在普通型骨肉瘤中的陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤,HER-2在普通型骨肉瘤中的陽性率與高分化型骨肉瘤無明顯差異;有肺部或其它部位轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者EGFR陽性率顯著高于無轉(zhuǎn)移組,HER-2在有骨肉瘤轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組中的表達無明顯差異;TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織EGFR陽性率與Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組織比較,差異有顯著性(P均<0.05);TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織HER-2陽性率與Ⅱ+Ⅲ期、Ⅳ期比較,差異無顯著性(P>0.05,表1)。
2.4骨肉瘤中HER-2表達與EGFR表達的相關(guān)性45例骨肉瘤中,9例EGFR、HER-2共表達,25例EGFR陽性、HER-2陰性,無HER-2陽性、EGFR陰性骨肉瘤。采用Spearman相關(guān)分析,骨肉瘤中HER-2與EGFR表達,無顯著相關(guān)性。
表1 EGFR、HER-2表達與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系
HER家族(HER-1/EGFR、HER-2、HER-3、HER-4)受體蛋白在腫瘤發(fā)生和疾病進展中起關(guān)鍵性作用,它們與相應的配體結(jié)合后,形成同源二聚體或異源二聚體,使受體的酪氨酸激酶發(fā)生自磷酸化,從而激活細胞內(nèi)的信號傳導通路,調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、血管發(fā)生、黏附和運動性。許多腫瘤發(fā)生均與該受體突變、過表達、自泌反饋環(huán)刺激等導致的EGFR激活有關(guān)[2]。EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達產(chǎn)物,與腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞的凋亡等密切相關(guān)。EGFR在多種腫瘤中如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在高表達或基因擴增[3-5]。
本組結(jié)果顯示:EGFR在骨肉瘤組織中的陽性率為75.6%,且與腫瘤分化程度、TNM分期、肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。普通型骨肉瘤組EGFR陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤。TNM分期Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組EGFR陽性率明顯高于Ⅰ期組。EGFR陽性增加骨肉瘤患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風險。提示EGFR參與骨肉瘤的瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。EGFR蛋白表達可作為骨肉瘤惡性程度判斷指標。EGFR靶向抑制劑,在針對不同腫瘤的治療中,取得顯著的療效[6]。2004年美國FDA批準酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼用于攜帶EGFR基因突變的晚期非小細胞肺癌患者的治療;然而酪氨酸激酶抑制劑目前尚未用于治療骨肉瘤。EGFR陽性率與正常骨組織相比顯著升高,且與骨肉瘤惡性程度密切相關(guān),提示EGFR可能成為骨肉瘤治療的靶點。EGFR抑制劑發(fā)揮直接的抗骨肉瘤效應并呈劑量依賴的方式[7],研發(fā)新的EGFR抑制劑可以成為骨肉瘤治療的有效途徑。
HER-2與EGFR具有約50%的同源性,可接受表皮生長因子樣物質(zhì)的信息,刺激細胞增殖,具有酪氨酸激酶的活性。在15%~20%的乳腺中發(fā)現(xiàn)HER-2過表達,HER-2靶向藥物曲妥珠單抗成為治療乳腺癌最有希望的突破之一[8-9]。HER-2在食管鱗狀細胞癌中也存在過表達,是潛在預后好的指標[10]。本組結(jié)果顯示HER-2在骨肉瘤中陽性率為20%,比Mardanpour等[11]報道的結(jié)果稍低。本組骨肉瘤中9例HER-2陽性者,EGFR均陽性,提示兩者的表達有一定關(guān)系,但分析結(jié)果顯示兩者的相關(guān)性無顯著性,可能與樣本量相對較小有關(guān)。本實驗未發(fā)現(xiàn)HER-2表達與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性,提示HER-2陽性不能成為骨肉瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移的危險因素。
綜上所述,骨肉瘤中EGFR表達增高與骨肉瘤分化程度、TNM分期密切相關(guān),與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展,并促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移,其可作為骨肉瘤惡性程度的判斷指標。
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