秦曉飛，張勇勇，陳文吉，韓 志

骨肉瘤是全球青少年最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，由于轉(zhuǎn)移和化療抵抗，骨肉瘤患者預后較差。廣泛的腫瘤切除，新輔助放、化療使骨肉瘤患者存活率有顯著改善，但5年生存率仍保持15%～30%[1]。尋找判斷腫瘤的預后或?qū)εR床治療具有指導意義的分子標記并進行選擇性靶向治療，對提高骨肉瘤治療的效果有重要意義。兩者作為肺癌、乳腺癌、胃癌等靶向治療的靶點及化療耐藥相關(guān)的基因得到廣泛深入的研究，并已應用于臨床。本文檢測骨肉瘤中EGFR、HER-2的表達，分析EGFR、HER-2在骨肉瘤中的作用及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為骨肉瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集2009年1月～2016年12月河南省洛陽正骨醫(yī)院收治的骨肉瘤45例，其中男性27例，女性18例，年齡10～64歲，平均28歲，中位年齡20.5歲，病程15天～18個月；組織學類型：低級別骨肉瘤8例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例、皮質(zhì)旁骨肉瘤3例)，普通型骨肉瘤37例。入組標準：(1)經(jīng)術(shù)前病理穿刺確診為骨肉瘤；(2)穿刺前未經(jīng)放、化療及藥物治療；(3)在我院擬采取新輔助化療后手術(shù)治療。排除標準：(1)合并有除骨肉瘤以外的其他惡性腫瘤；(2)合并嚴重的心肝腎等系統(tǒng)性疾病。本實驗獲醫(yī)院倫理委員會審核，患者均知情同意。另收集37例骨肉瘤患者腫瘤周圍正常骨組織作為對照。

1.2試劑兔抗人單克隆抗體EGFR、HER-2及EnVision法檢測試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3方法活檢的腫瘤組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，包埋石蠟，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟水化；磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加EGFR、HER-2一抗，4 ℃過夜；磷酸緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖液沖洗，DAB顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水透明，封固。

1.4結(jié)果判斷EGFR陽性表達于胞膜或胞質(zhì)，HER-2陽性表達于胞膜，陽性信號均為淡黃色至棕褐色。結(jié)果判讀采用半定量計分法，即染色強度結(jié)合陽性腫瘤細胞百分比綜合評分。按染色強度標準計分：細胞弱著色，即陽性信號在400倍視野下可見但在低倍視野下不清晰為1分；細胞中度著色，即陽性信號在40倍視野下清晰可見為2分；細胞強著色，即陽性信號在40倍視野下清晰可見為3分。按陽性細胞百分比標準計分：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：0分為不表達；1～2分為弱表達；3～6分為中度表達；7～9分為強表達。將不表達和弱表達定義為陰性，中度表達和強表達定義為陽性。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。陽性率比較采用χ2檢驗，應用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1EGFR在骨肉瘤中的表達45例患者骨肉瘤組織中EGFR陽性34例(75.6%)，其中24例強陽性(圖1)，11例陰性(24.4%)。腫瘤周圍正常骨組織中未見EGFR表達。骨肉瘤組織中EGFR蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

2.2HER-2在骨肉瘤中的表達45例患者骨肉瘤組織HER-2陽性9例(20%)(圖2)，陰性36例(80%)，未見有強陽性。腫瘤周圍正常骨組織中未見HER-2表達。骨肉瘤組織中HER-2蛋白陽性率高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

①②

圖1EGFR在骨肉瘤組織中的表達，EnVision法圖2HER-2在骨肉瘤組織中的表達，EnVision法

2.3EGFR、HER-2表達與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系EGFR、HER-2表達與骨肉瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P均>0.05)；EGFR在普通型骨肉瘤中的陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤，HER-2在普通型骨肉瘤中的陽性率與高分化型骨肉瘤無明顯差異；有肺部或其它部位轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者EGFR陽性率顯著高于無轉(zhuǎn)移組，HER-2在有骨肉瘤轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組中的表達無明顯差異；TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織EGFR陽性率與Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組織比較，差異有顯著性(P均<0.05)；TNM分期Ⅰ期骨肉瘤組織HER-2陽性率與Ⅱ+Ⅲ期、Ⅳ期比較，差異無顯著性(P>0.05，表1)。

2.4骨肉瘤中HER-2表達與EGFR表達的相關(guān)性45例骨肉瘤中，9例EGFR、HER-2共表達，25例EGFR陽性、HER-2陰性，無HER-2陽性、EGFR陰性骨肉瘤。采用Spearman相關(guān)分析，骨肉瘤中HER-2與EGFR表達，無顯著相關(guān)性。

表1 EGFR、HER-2表達與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

HER家族(HER-1/EGFR、HER-2、HER-3、HER-4)受體蛋白在腫瘤發(fā)生和疾病進展中起關(guān)鍵性作用，它們與相應的配體結(jié)合后，形成同源二聚體或異源二聚體，使受體的酪氨酸激酶發(fā)生自磷酸化，從而激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、血管發(fā)生、黏附和運動性。許多腫瘤發(fā)生均與該受體突變、過表達、自泌反饋環(huán)刺激等導致的EGFR激活有關(guān)[2]。EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達產(chǎn)物，與腫瘤細胞的增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞的凋亡等密切相關(guān)。EGFR在多種腫瘤中如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在高表達或基因擴增[3-5]。

本組結(jié)果顯示：EGFR在骨肉瘤組織中的陽性率為75.6%，且與腫瘤分化程度、TNM分期、肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。普通型骨肉瘤組EGFR陽性率顯著高于高分化型骨肉瘤。TNM分期Ⅱ+Ⅲ、Ⅳ期組EGFR陽性率明顯高于Ⅰ期組。EGFR陽性增加骨肉瘤患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風險。提示EGFR參與骨肉瘤的瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。EGFR蛋白表達可作為骨肉瘤惡性程度判斷指標。EGFR靶向抑制劑，在針對不同腫瘤的治療中，取得顯著的療效[6]。2004年美國FDA批準酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼用于攜帶EGFR基因突變的晚期非小細胞肺癌患者的治療；然而酪氨酸激酶抑制劑目前尚未用于治療骨肉瘤。EGFR陽性率與正常骨組織相比顯著升高，且與骨肉瘤惡性程度密切相關(guān)，提示EGFR可能成為骨肉瘤治療的靶點。EGFR抑制劑發(fā)揮直接的抗骨肉瘤效應并呈劑量依賴的方式[7]，研發(fā)新的EGFR抑制劑可以成為骨肉瘤治療的有效途徑。

HER-2與EGFR具有約50%的同源性，可接受表皮生長因子樣物質(zhì)的信息，刺激細胞增殖，具有酪氨酸激酶的活性。在15%～20%的乳腺中發(fā)現(xiàn)HER-2過表達，HER-2靶向藥物曲妥珠單抗成為治療乳腺癌最有希望的突破之一[8-9]。HER-2在食管鱗狀細胞癌中也存在過表達，是潛在預后好的指標[10]。本組結(jié)果顯示HER-2在骨肉瘤中陽性率為20%，比Mardanpour等[11]報道的結(jié)果稍低。本組骨肉瘤中9例HER-2陽性者，EGFR均陽性，提示兩者的表達有一定關(guān)系，但分析結(jié)果顯示兩者的相關(guān)性無顯著性，可能與樣本量相對較小有關(guān)。本實驗未發(fā)現(xiàn)HER-2表達與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，提示HER-2陽性不能成為骨肉瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移的危險因素。

綜上所述，骨肉瘤中EGFR表達增高與骨肉瘤分化程度、TNM分期密切相關(guān)，與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，并促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移，其可作為骨肉瘤惡性程度的判斷指標。

[1] Luetke A, Meyers P A, Lewis I, Juergens H. Osteosarcoma treatment-where do we stand? A state of the art review[J]. Cancer Treat Rev, 2014,40(4):523-532.

[2] Hirsch F R, Scagliotti G V, Langer C J,etal. Epidermal growth factor family of receptors in preneoplasia and lung cancer: perspectives for targeted therapies[J]. Lung Cancer, 2003,41(Suppl 1):s29-s42.

[3] Kishiki T, Ohnishi H, Masaki T,etal. Impact of genetic profiles on the efficacy of anti-EGFR antibodies in metastatic colorectal cancer with KRAS mutation[J]. Oncol Rep, 2014,32(1):57-64.

[4] Fiala O, Pesek M, Finek J,etal. Retreatment with erlotinib of a patient with metastatic NSCLC harboring EGFR mutation: a case report[J]. Tumori, 2014,100(3):70-73.

[5] Bi W W, Zhang W H, Yin G H,etal. Analysis of indoleamine2-3 dioxygenase(IDO)and EGFR coexpression in breast cancer tissue by immunohistochemistry[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(14):5535-5538.

[6] Antonicelli A, Cafarotti S, Indini A,etal. EGFR-targeted therapy for non-small cell lung cancer focus on EGFR oncogenic mutation[J]. Int J Med Sci, 2013,10(3):320-330.

[7] Liu J, Wu J, Zhou L,etal. ZD6474, a new treatment strategy for human osteosarcoma, and its potential synergistic effect with celecoxib[J]. Oncotarget, 2015,6(25):21341-21352.

[8] Ramakrishna N, Temin S, Chandarlapaty S,etal. Recommendations on disease management for patients with advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline[J]. J Clin Oncol, 2014,32(19):2100-2108.

[9] Partridge A H, Rumble R B, Carey L A,etal. Chemotherapy and targeted therapy for women with human epidermal growth factor receptor 2-negative (or unknown) advanced breast cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline[J]. J Clin Oncol, 2014,32(29):3307-3329.

[10] 黃 潔，蔣冬先，侯英勇，等. 食管鱗狀細胞癌中HER-2基因擴增和蛋白表達[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2017,33(6):618-622.

[11] Mardanpour K, Rahbar M, Mardanpour S. Coexistence of HER2, Ki67, and p53 in osteosarcoma: a strong prognostic factor[J]. N Am J Med Sci, 2016,8(5):210-214.