陳雅琪，蹇順海，黃一凡，文 彬

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，95%的組織學類型為鱗狀細胞癌。GFRα3蛋白是膠質細胞源神經營養(yǎng)因子配體家族成員ARTN的特異性受體之一。GFRα3蛋白與ARTN特異性結合，能激活下游信號通路[1]。研究發(fā)現(xiàn)，GFRα3蛋白在胰腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中表達，促進胰腺癌的神經侵襲[2]；與乳腺癌淋巴結轉移、臨床分期及預后相關[3]。目前尚無GFRα3蛋白與食管鱗狀細胞癌病理特征相關的研究，本實驗通過檢測GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達，探討其與食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移以及預后的關系。

1 材料與方法

1.1材料(1)收集2009年1月1日～2010年9月30日川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院存檔確診的食管鱗狀細胞癌石蠟標本114例，患者年齡39～82歲，平均(57.2±4.23)歲，另選取高級別上皮內瘤變及原位癌標本17例，年齡42～75歲，平均(59.6±6.37)歲；癌旁正常食管組織25例作對照，年齡49～78歲，平均(61.4±5.72)歲；所有標本術前均未經放、化療，術前簽署相關知情同意書，符合醫(yī)學倫理學規(guī)定。 (2)收集2014年3月～2014年6月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心胸外科手術切除的新鮮食管腫瘤組織及距腫瘤大于5 cm的正常組織12對，年齡42～72歲，平均(59.4±5.12)歲，其中男性9例，女性3例，術后確診為食管鱗狀細胞癌；切除后置于冰上，生理鹽水沖洗后分裝于冷凍管，放于冷凍盒中于-80 ℃冰箱保存。所選樣本來源的患者術前均未經放、化療，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組化 GFRα3蛋白兔抗人多克隆抗體購自Atlas公司(HPA020731稀釋濃度1 ∶600)，所選蠟塊冷凍后每個切片3 μm厚，以胰腺癌標本做陽性對照，組織本身做陰性內對照，免疫組化采用SP兩步法檢測GFRα3蛋白的表達。GFRα3蛋白陽性信號呈棕黃色顆粒，定位于鱗狀上皮細胞膜或細胞質。結果判定以GFRα3蛋白陽性染色范圍及著色強度共同確定，按陽性細胞所占百分比計分：無陽性細胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。按著色強度計分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者分數(shù)相加為總積分，由兩位副高及以上級別病理醫(yī)師共同打分，最后取平均分，≤2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性()，6～7分為強陽性()。

1.2.2Western blot檢測 蛋白提取，BCA蛋白濃度測定，凝膠配置試劑盒、上樣緩沖液、電泳液、轉膜液、PVDF膜、超敏ECL發(fā)光液購于碧云天公司。具體操作步驟按試劑盒說明書進行，取食管鱗狀細胞癌組織、癌旁組織各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混勻，冰上裂解，低溫離心，取上清液分裝，上清液按4 ∶1加電泳緩沖液于PCR儀上99 ℃變性15 min，與配置好的凝膠上樣電泳，濃縮膠80 V至分離膠時，改為120 V電泳至分離膠底部，剪裁與膠相適大小PVDF膜，甲醇中活化15 s，轉膜，5%脫脂奶粉封閉3 h；4 ℃冰箱內一抗(GFRα3蛋白濃度1 ∶250，GAPDH濃度1 ∶2 000)過夜，次日常溫二抗(1 ∶5 000)60 min，ECL發(fā)光，圖像采集。

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間對比采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier曲線，用對數(shù)秩檢驗圖表示。

2 結果

2.1不同食管組織中GFRα3蛋白的表達GFRα3蛋白主要定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色或棕褐色。GFRα3蛋白在25例正常食管黏膜上皮中不表達，在高級別上皮內瘤變及原位癌組織和食管鱗狀細胞癌中的陽性率分別為29.4%、76.3%。其在癌組織的陽性率明顯高于高級別上皮內瘤變及原位癌組織、正常食管黏膜上皮，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1，圖1)。

ABCD

圖1A.GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞膜和細胞質中呈()，SP兩步法；B.GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞膜和細胞質中呈()，SP兩步法；C. GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌細胞膜和細胞質中呈(+)，SP兩步法；D. GFRα3蛋白在原位癌組織中呈(+)，SP兩步法

表1 不同食管組織中GFRα3蛋白的表達

N為正常組織；H+S為高級別上皮內瘤變及原位癌組織；ESCC為食管鱗狀細胞癌組織；△與H+S比較，P<0.05；○與ESCC比較，P<0.01；◇與N比較，P<0.01

2.2GFRα3蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系114例食管鱗狀細胞癌中，男性89例，女性25例；年齡39～82歲，中位年齡57歲。統(tǒng)計GFRα3蛋白與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系，GFRα3蛋白表達與浸潤深度、TNM分期有關(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 GFRα3蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

2.3Westernblot檢測GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達術中搜集并經術后病理確診的食管鱗狀細胞癌組織12例，以距離其大于5 cm的癌旁組織為對照。Western blot檢測并以相對分子質量3.6×104的GAPDH作內參，相對表達量以GFRα3蛋白與GAPDH灰度值比值表示，觀察GFRα3蛋白在兩組中的表達。結果發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌組織和正常組織中均有不同程度的表達，且在食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)。

圖2 食管鱗狀細胞癌組織及正常組織中GFRα3蛋白的表達

2.4生存分析評價GFRα3蛋白表達與食管鱗狀細胞癌患者預后的關系，本實驗通過電話對患者進行回訪，以手術出院之日開始隨訪，隨訪60個月共獲得39例資料。其中18例存活，總生存率46.2%。13例GFRα3蛋白陽性生存率為23.1%(3/13)，26例陰性組生存率57.7%(15/26)，GFRα3蛋白陽性組生存率明顯低于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 食管鱗狀細胞癌組織中GFRα3蛋白表達與患者生存率的關系

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，類型以鱗狀細胞癌為主，我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，2012年新發(fā)病例和死亡病例達22.3萬和19.7萬，約占全球發(fā)病和死亡人數(shù)的一半，5年生存率約20%[4]；在川東北地區(qū)食管癌發(fā)病率位居第一位[5]。食管癌患者早期臨床癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，有癥狀者入院時檢查發(fā)現(xiàn)大多已為中晚期，是造成患者死亡的重要因素。因此，尋找新的早期診斷方法至關重要。GFRα3蛋白為糖基化磷脂酰肌醇細胞膜表面受體，是膠質細胞源神經營養(yǎng)因子受體家族成員之一，位于染色體5q31.2，編碼400個氨基酸[6]，與其上游神經營養(yǎng)因子配基ARTN及下游的定位于細胞膜上的因子RET形成復合物，向細胞內傳導信號[7]，除維持機體神經元存活外，也與惡性腫瘤的發(fā)生相關[8]，但GFRα3蛋白在食管鱗狀細胞癌中的作用尚不明確，本實驗分析GFRα3蛋白在食管癌前病變及食管鱗狀細胞癌中的表達，腫瘤發(fā)生是逐步演化的過程，從正常組織到高級別上皮內瘤變及原位癌組織，GFRα3蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，腫瘤發(fā)展到鱗狀細胞癌GFRα3蛋白表達進一步升高(P<0.01)，Western blot實驗也證實GFRα3蛋白在鱗狀細胞癌組織中表達高于正常組織(P<0.01)，隨著疾病發(fā)展，GFRα3蛋白表達逐級升高，臨床上可通過檢測GFRα3蛋白表達水平來預測疾病進展。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，GFRα3蛋白表達水平與患者腫瘤浸潤深度、臨床分期及預后相關，浸潤越深，GFRα3蛋白表達越高；臨床分期越晚，GFRα3蛋白表達越高，術后生存率越低。提示在食管鱗狀細胞癌臨床進展中，GFRα3蛋白也起重要作用。其作用機制不明，可能與其上游配基因子ARTN一樣，通過促進腫瘤細胞增殖及生存期來促進腫瘤生長，并促進上皮到間充質的轉變及血管生成加強癌癥干細胞的生物行為，進而表現(xiàn)為腫瘤的生物學行為[9-10]。另查閱文獻GFRα3蛋白能在其他惡性腫瘤中表達，Wu等[3]應用免疫組化及原位雜交法分析GFRα3蛋白及mRNA在乳腺良性病變及乳腺癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯升高，并與淋巴結轉移、臨床分期、HER-2表達及預后相關；朱棟良等[2]研究 GFRα3蛋白的表達與胰腺癌生物學關系，結果發(fā)現(xiàn)GFRα3蛋白與胰腺癌臨床分期、淋巴結轉移及神經侵襲相關。

以上研究結果與本實驗大致相符，但是在食管鱗狀細胞癌中，GFRα3蛋白表達與淋巴結轉移無關，這與以上兩種惡性腫瘤不符，推測原因：(1)GFRα3蛋白是一個與神經侵襲相關因子配基受體，可能本實驗選取樣本神經侵襲與淋巴結轉移是兩個獨立的過程，兩者之間無明顯影響，與繆錦峰等[11]的觀點相符；(2)不同組織起源腫瘤之間發(fā)病機制本身存在差異，GFRα3蛋白是否與食管鱗狀細胞癌神經侵襲有關，對食管癌擴散方式的認識、治療方法的選擇意義重大。

綜上所述，本實驗證明GFRα3蛋白在食管癌前病變到食管鱗狀細胞癌進展過程中表達逐漸升高，且與患者臨床分期及預后相關，推測GFRα3蛋白參與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，有望成為患者臨床分期及預后的新生物學指標。

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