牟 浪，吳正升，吳 強

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，占中國女性癌癥的15%，同時也是全球女性癌癥死亡的首要原因[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌患者致死的主要原因[2]，因此探索腫瘤轉(zhuǎn)移的機制，改善乳腺癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。CD98hc(也稱為4F2hc/SLC3A2)是溶質(zhì)載體家族的一員，相對分子質(zhì)量為8.5×104的單跨膜糖蛋白[3]。CD98hc可通過激活I(lǐng)ntegrin信號通路，促進腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附能力減弱，從而使腫瘤細(xì)胞易發(fā)生遷徙、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致惡性程度增高，預(yù)后不良[4]。本實驗通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中CD98hc分子的表達(dá)，分析其對MDA-MB-231細(xì)胞增殖侵襲力的影響，為進一步闡明乳腺癌侵襲遷移機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑兔抗人CD98單克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Calbiochem公司；TRIzol購自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、實時熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司；MTT試劑盒購自Promega公司；Transwell小室購自Corning公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；MDA-MB-231細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1CD98hc-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)shRNA設(shè)計原則，靶向設(shè)計CD98hc的shRNA，上游：5′-CCGGTGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCATTTTTG-3′，下游：5′-A ATTCAAAAATGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCA-3′。退火處理：95 ℃ 5 min，85 ℃ 5 min，75 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。用SolutionⅠ連接酶將準(zhǔn)備好的插入片段連接到載體Plko.1，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌落，抽取質(zhì)粒，酶切并鑒定。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、2%L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，適時更換培養(yǎng)基和傳代。實驗時選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.3MDA-MB-231穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞2×105個接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待融合度達(dá)60%按質(zhì)粒 ∶脂質(zhì)體=1 ∶2的比例轉(zhuǎn)染實驗組CD98hc表達(dá)質(zhì)粒(CD98hc-shRNA)、對照組空載質(zhì)粒(Vector)，具體操作步驟按Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行，培養(yǎng)48 h后按4 μL/mL添加Puromycin, 適時更換培養(yǎng)基。分別獲得下調(diào)CD98hc的MDA-MB-231細(xì)胞株和對照MDA-MB-231細(xì)胞株。收集細(xì)胞進行Western blot和qRT-PCR技術(shù)鑒定，鑒定成功后用于后續(xù)的實驗。

1.2.4Western blot檢測 收集待檢測細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取蛋白后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜后，應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光，采集圖像。

1.2.5qRT-PCR檢測 采用qRT-PCR法檢測CD98hc的mRNA表達(dá)。收集待檢測細(xì)胞，利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄。CD98hc定量PCR引物上游：5′-TCCGACTCTACCAGCTGATGC-3′，下游：5′-AAGCTG GACTCATCCCACAGC-3′。GAPDH引物序列上游：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游：5′-GGCA TGGACTGTGGTCATGAG-3′。引物序列合成由上海生工公司完成。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 30 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，退火溫度后采集熒光信號，合計40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)出，繪制柱狀圖。

1.2.6MTT實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞活力 常規(guī)洗滌并用胰酶消化待檢測的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，每孔1×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每個處理組重復(fù)6孔，合計培養(yǎng)5個96孔板。于24 h后檢測細(xì)胞活力，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT液，置培養(yǎng)箱孵育2 h。棄上清，每孔加入DMSO 100 μL。震蕩10 min，在570 nm處測定各孔吸光度OD值，結(jié)果取平均值。

1.2.7Transwell實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞侵襲遷移能力 用胰酶消化各組細(xì)胞，PBS洗1～2次，用含10 g/L的BSA無血清培養(yǎng)基重懸，每組取1×105個細(xì)胞加入預(yù)先用Matrigel包被基膜的Transwell小室的上室中，下室加入含血清的完全培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，PBS清洗，用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細(xì)胞，90%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡下觀察，每個樣本隨機計數(shù)5個視野，取平均值，繪制柱狀圖。檢測細(xì)胞遷移時，小室上室中不需要Matrigel包被基膜，其他步驟與之相同。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞中CD98hc的表達(dá)應(yīng)用qRT-PCR檢測CD98hc的mRNA水平表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與空白組(1.040±0.056)、對照組(1.293±0.006)相比，實驗組(0.527±0.045)在mRNA水平表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，空白組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示：CD98hc-shRNA組CD98hc蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，蛋白表達(dá)的抑制作用明顯(圖1B)。

圖1 A.qRT-PCR檢測MDA-MB-231細(xì)胞CD98hc干涉情況；B.Western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞CD98干涉情況

2.2下調(diào)表達(dá)CD98hc分子抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖應(yīng)用MTT實驗檢測CD98hc分子對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h后CD98hc-shRNA組(0.580±0.035)細(xì)胞的增殖與空白組(0.706±0.013)、對照組(0.724±0.018)相比受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空白組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 MTT檢測CD98hc分子對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用

③A③B③C④A④B④C

圖3下調(diào)CD98hc顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力：A. 空白組；B. 對照組； C. CD98hc-shRNA組圖4下調(diào)CD98hc顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力：A. 空白組；B. 對照組； C. CD98hc-shRNA組

2.3下調(diào)表達(dá)CD98hc分子抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲及遷移應(yīng)用Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲及遷移的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD98hc-shRNA組(108±4.5)穿過Matrigel包被的細(xì)胞數(shù)與空白組(377±20.9)、對照組(394.6±9.8)相比明顯減少(P<0.05)。穿過未包被的微孔膜的細(xì)胞數(shù)CD98hc-shRNA組(118.4±13.1)也明顯少于空白組(385.2±27.3)和對照組(405.2±13.8)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空白組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3、4)。

3 討論

CD98hc首次被發(fā)現(xiàn)是作為T淋巴細(xì)胞的表面抗原[5]，隨后發(fā)現(xiàn)CD98hc在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)，CD98hc具有雙重功能，其中胞膜外區(qū)可通過二硫鍵與6種L型氨基酸轉(zhuǎn)運體(LAT1、LAT2、xCT、y+LAT1、y+LAT2和asc1)共價結(jié)合，構(gòu)成的氨基酸轉(zhuǎn)運體是其運輸氨基酸的必需組分[6-7]，保證腫瘤細(xì)胞對氨基酸的大量需求，維持腫瘤細(xì)胞的快速增殖能力[8]。CD98hc的胞質(zhì)區(qū)可通過調(diào)節(jié)Integrin樣信號通路來改變細(xì)胞的存活、遷徙甚至是轉(zhuǎn)移[9]。

CD98hc在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[10]。Fei等[11]報道，CD98hc在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且與CD98hc陰性的肺癌患者相比，CD98hc陽性患者總體生存率減低、復(fù)發(fā)率增高。Shin等[12]發(fā)現(xiàn)SLC3A2基因能與神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(neuregulin 1, NRG1)融合，該基因融合能夠促進肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移。CD98hc可通過增強Rho激酶(ROCK)的活性以及YAP/TPZ 的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進胃腸道的轉(zhuǎn)移[13]。CD98hc還可與左旋氨基酸轉(zhuǎn)移蛋白1(L-type amino acid transporter 1, LAT1)結(jié)合，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[14]。Poettler等[15]實驗得出在腎透明細(xì)胞癌中沉默CD98hc的表達(dá)能夠一定程度抑制細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等腫瘤特性。該現(xiàn)象在膠質(zhì)瘤中也有發(fā)生[16]，但在乳腺癌中還未見相關(guān)報道。本組實驗結(jié)果顯示：沉默CD98hc在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力，與其他腫瘤的研究結(jié)果一致。提示CD98hc可能參與乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控，但關(guān)于其調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)行為的作用機制還有待于進一步分析。

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