袁會(huì)軍 劉斌 楊艷麗 范鈺 李晶晶

Wee1蛋白激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸家族成員之一，在進(jìn)化上高度保守并大量存在于多種真核生物中，在細(xì)胞周期的S期和G2期非?；钴S。Wee1最初由Nurse［1］從裂殖酵母細(xì)胞中分離出來，由于其可通過抑制細(xì)胞分裂控制蛋白2（cell division control protein 2，Cdc2，芽殖酵母中稱Cdc28，人類中稱CDK1）活性，從而抑制細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂致使真核生物細(xì)胞體積減小，故將其命名為“Wee”家族。Wee1蛋白激酶是DNA復(fù)制、染色體濃縮、組蛋白轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵調(diào)控中樞，這些生物學(xué)行為異常可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，引起惡性腫瘤發(fā)生［2］，但在惡性腫瘤中抑制或下調(diào)Wee1蛋白激酶的表達(dá)，可引發(fā)有絲分裂災(zāi)難和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。本文就Wee1蛋白激酶的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Wee1蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Wee家族包括Wee1A、Wee1B和Myt1，Wee1A存在于體細(xì)胞中；Wee1B存在于胚細(xì)胞中；Myt1在體細(xì)胞和胚細(xì)胞中均表達(dá)［3］。人Wee1基因位于11p15.3～p15.1，能轉(zhuǎn)錄一個(gè)3 kD的mRAN，編碼含有647個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量大小為94 kD［4］。該蛋白激酶包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端調(diào)節(jié)域、中心激酶結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)節(jié)域［5］。其mRNA的3'端和5'端各有兩種長(zhǎng)短不一的非翻譯區(qū)，3'端序列上有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)，能被泛素化系統(tǒng)識(shí)別和降解，5'端則會(huì)影響其半衰期［6］。

在細(xì)胞周期間期，Wee1蛋白激酶活性的維持依靠其與14-3-3β蛋白結(jié)合及其自身磷酸化；在細(xì)胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通過CDK1介導(dǎo)的磷酸化負(fù)反饋機(jī)制、與14-3-3β蛋白結(jié)合及其他磷酸化激酶作用機(jī)制下調(diào)其活性；在細(xì)胞M期，β-TrCP與Wee1蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)Ser53和PS121結(jié)合，導(dǎo)致Wee1蛋白激酶降解［7］。

2 Wee1蛋白激酶在細(xì)胞周期中的作用

細(xì)胞周期是指真核細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程。真核細(xì)胞增殖必須依次經(jīng)歷其準(zhǔn)備階段的間期和有絲分裂期，即前一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)相必須在下一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)相開始前結(jié)束。細(xì)胞周期能否正確運(yùn)行和按序完成細(xì)胞周期事件，受控于精準(zhǔn)的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的核心成分是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDKs（cyclin-dependent kinase，CDKs）［8］，為確保細(xì)胞周期事件發(fā)生的時(shí)相性和協(xié)同性，CDKs的時(shí)相性激活在細(xì)胞周期中尤為重要，它主要依賴細(xì)胞周期蛋白（cyclins）的特異性或時(shí)相性表達(dá)、積累和分解。

CDKs與cyclins結(jié)合形成的CDKs/Cyclins復(fù)合物稱為有絲分裂促進(jìn)因子（mitosis promoting factor，MPF），其調(diào)控細(xì)胞周期各個(gè)環(huán)節(jié)的啟動(dòng)與進(jìn)展，進(jìn)而控制細(xì)胞增生與凋亡，CDKs是MPF的催化亞基，cyclins是MPF的調(diào)節(jié)亞基。在細(xì)胞G2/M期，Wee1蛋白激酶通過磷酸化CDK1的Tyr15位點(diǎn)，抑制CDK1活性使CDK1/Cyclin B復(fù)合物失活，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂期；在細(xì)胞S期，Wee1蛋白激酶作為“染色質(zhì)合成傳感器”，有兩個(gè)連續(xù)的磷酸化事件，一是在整個(gè)細(xì)胞S期磷酸化CDK1的Tyr15位點(diǎn)，防止細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)相，直到DNA復(fù)制或修復(fù)完成；二是磷酸化組蛋白H2B的Tyr37位點(diǎn)，終止組蛋白合成，在進(jìn)入有絲分裂期前維持正確的組蛋白與DNA比例［9］。由于DNA合成與組蛋白轉(zhuǎn)錄的耦合對(duì)染色體形成至關(guān)重要，因此這兩個(gè)過程使Wee1蛋白激酶成為維持染色體完整性的主要調(diào)節(jié)者。

最近研究［10］表明，Wee1蛋白激酶參與DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)和復(fù)制叉停滯維持，通過調(diào)節(jié)CDK2活性，Wee1蛋白激酶磷酸化和失活CDK2/Cyclin E復(fù)合物，進(jìn)而在細(xì)胞S期控制和調(diào)節(jié)DNA復(fù)制。在Wee1蛋白激酶缺乏的細(xì)胞中增強(qiáng)CDK2活性，可導(dǎo)致復(fù)制起始協(xié)調(diào)性失控、分裂過程中DNA結(jié)構(gòu)異常，引起基因組不穩(wěn)定。

3 Wee1蛋白激酶在DNA損傷反應(yīng)中的作用

DNA存儲(chǔ)著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素可導(dǎo)致DNA分子損傷或改變，如果DNA損傷或遺傳信息的改變不能更正，會(huì)影響基因組的穩(wěn)定性。真核細(xì)胞依賴復(fù)雜的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)和DNA修復(fù)系統(tǒng)確保基因組的穩(wěn)定性，在細(xì)胞DNA受到化學(xué)性或放射性損傷后，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)被激活，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程而使DNA修復(fù)。DNA修復(fù)途徑主要有二個(gè)分支：毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因（ataxia t elangiectasia-mutatedkinase，ATM）/檢查點(diǎn)激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）和ATR（ATM and rad3-related kinase，ATR）/Chk1（checkpoint kinase 1，Chk1）通路，這兩條通路存在較多聯(lián)系。ATM可被電離輻射、放療和引起DNA雙鏈損傷的藥物激活，ATM可磷酸化和激活Chk2，Cdc25c磷酸酶的Ser216位點(diǎn)，生成一個(gè)能與14-3-3δ蛋白結(jié)合的位點(diǎn)封閉Cdc25c磷酸酶出入細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)出口，有效滅活Cdc25c磷酸酶活性，使CDK1處于無功能狀態(tài)，CDK1/Cyclin B復(fù)合物亦無活性，細(xì)胞周期便不能進(jìn)入有絲分裂期［11］。ATR可被廣泛的基因毒性刺激，進(jìn)而導(dǎo)致DNA單鏈斷裂而激活［12］。此外，ATR可依賴ATM激活而激活，發(fā)生在雙鏈DNA斷裂的過程中［13］，ATR是負(fù)責(zé)磷酸化、激活Chk1的主要激酶，與Chk2相比，Chk1能被ATM和ATR同時(shí)激活，可發(fā)生在正常的細(xì)胞周期過程中或在響應(yīng)細(xì)胞復(fù)制壓力時(shí)（比如在復(fù)制叉停滯期），Chk1可同時(shí)磷酸化、激活Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶，Wee1蛋白激酶磷酸化CDK1/Cyclin B復(fù)合物CDK1的Tyr15位點(diǎn)，使其失活，結(jié)果使細(xì)胞周期阻止在G2期，進(jìn)行DNA修復(fù)。Cdc25c磷酸酶可去磷酸化作用CDK1的Tyr15位點(diǎn)，使其恢復(fù)活性，結(jié)果使細(xì)胞周期進(jìn)入M期?？梢娂?xì)胞周期能否進(jìn)入M期，取決于Wee1蛋白激酶和Cdc25c磷酸酶的平衡狀態(tài)。

4 Wee1蛋白激酶與腫瘤

4.1 Wee1蛋白激酶與腫瘤的相關(guān)性

惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞失控性增生，涉及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制及DNA損傷修復(fù)的細(xì)胞傳導(dǎo)通路改變。有研究指出，M期細(xì)胞周期蛋白與腫瘤關(guān)系密切，其中CDK1/Cyclin B磷酸化調(diào)節(jié)機(jī)制缺陷與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［14-15］。p53基因主要在G1/S期對(duì)DNA損傷點(diǎn)進(jìn)行檢查，監(jiān)控基因組的完整性，但多數(shù)腫瘤細(xì)胞中p53基因缺失，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1檢查點(diǎn)缺陷，故在DNA復(fù)制及損傷修復(fù)過程中更加依賴于G2/M檢查點(diǎn)，促進(jìn)Wee1蛋白激酶大量表達(dá)，使CDK1/Cyclin B復(fù)合物不能被激活，間接引起Cyclin B過度積聚，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。當(dāng)降低Wee1蛋白含量時(shí)，可引起Fasligand誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)產(chǎn)生CDK1的Caspase依賴性激活［16］。

Wee1蛋白激酶作為重要的調(diào)節(jié)因子，在DNA復(fù)制、組蛋白合成和染色體濃縮等過程中起重要調(diào)節(jié)作用，這些過程的不穩(wěn)定都會(huì)使染色體的完整、遺傳和表觀遺傳信息傳遞受影響，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Wee1基因缺失或表達(dá)抑制后，可導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)激酶活性上調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難和細(xì)胞凋亡事件發(fā)生?？梢?，Wee1蛋白激酶既是腫瘤發(fā)生的原因，又是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

4.2 Wee1蛋白激酶與腫瘤治療

研究表明，Wee1蛋白激酶在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，如胰腺癌［17］、惡性黑色素瘤［18］和惡性膠質(zhì)瘤［19］等，其高表達(dá)與無病生存率相關(guān)［20］。抑制Wee1蛋白激酶表達(dá)可致G2檢測(cè)點(diǎn)廢除，允許細(xì)胞周期攜帶未修復(fù)的DNA進(jìn)入有絲分裂期，引發(fā)有絲分裂災(zāi)難，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。合成致死（synthetic lethality）是指兩個(gè)或多個(gè)非致死基因同時(shí)失活導(dǎo)致細(xì)胞死亡的現(xiàn)象［21］，如果腫瘤中存在特定基因失活，用藥物抑制其合成致死搭檔，可特異性殺死癌細(xì)胞，且不損害正常細(xì)胞。由于p53基因在腫瘤中缺失普遍，因此對(duì)于p53缺失的腫瘤，利用Wee1抑制劑可取得更好的效果［22］。此外，Wee1抑制劑與Chk1抑制劑具有協(xié)同效應(yīng)，能更好地殺死腫瘤細(xì)胞［23］。

4.3 Wee1抑制劑的臨床應(yīng)用

Wee1抑制劑有AZD-1775、PD0166285和PD0407824。PD0166285可同時(shí)抑制Wee1和Myt1；PD0407824是Wee1和Chk1的共同抑制劑；AZD1775是Wee1的特異性小分子抑制劑。此外，miR-194對(duì)Wee1亦有抑制作用。目前研究最多的是AZD-1775，其已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，被用于Wee1高表達(dá)的腫瘤，其耐受性良好，不良反應(yīng)較少。

HepG2/DDP細(xì)胞系是被敲除Wee1基因的肝癌細(xì)胞，Wee1蛋白激酶被沉默，可導(dǎo)致HepG2/DDP細(xì)胞系對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，同時(shí)也增加細(xì)胞凋亡的速度；GST、MRP1、LRP、BCL-2、Pgp、Survivin等蛋白表達(dá)水平在HepG2/DDP細(xì)胞系中明顯減少，MEK/ERK的磷酸化水平也顯著降低，說明Wee1可調(diào)節(jié)藥物相關(guān)基因的表達(dá)及MEK/ERK通路活性，從而控制人類肝癌細(xì)胞的耐藥性及增殖［24］。有研究顯示，Wee1在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中作為分支血管的推動(dòng)者，在腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展中起重要作用，AZD-1775可減少腫瘤血管形成的范圍而不依賴于對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響；在對(duì)比轉(zhuǎn)移病灶內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常肝組織相鄰的血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)上相似，但其分子表達(dá)不同［25］。在對(duì)Ⅳ期胃癌患者和伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的男性胃癌患者研究中，Wee1蛋白激酶具有較高的表達(dá)水平且其存活率較低；對(duì)胃癌細(xì)胞系（AGS、YCC-2、MKN28、KATOⅢ、SNU-1、SNU-5、SNU-16、SNU-216、SNU-601、SNU-638、SNU-668和SNU-719）的研究顯示，AZD-1775可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，在Wee1高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株中更有效，Wee1抑制劑聯(lián)合其他抗癌藥物（5-FU、紫杉醇等）較單獨(dú)應(yīng)用更有效［26］。胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系中，AZD-1775的抗腫瘤效果受DNA修復(fù)狀態(tài)影響，在DDR-P（DNA repair proficient）細(xì)胞系（MIA PaCa2和PANC-1）中的效果優(yōu)于含DNA修復(fù)基因（FANCC、FANCG和BRCA2）突變的細(xì)胞系（PL11、Hs 766T和Capan-1），單獨(dú)抑制Wee1可能無法提供臨床幫助，特別是FANCC、FANCG和BRCA2基因突變者［27］。三陰性乳腺癌的研究表明，順鉑治療誘導(dǎo)DNA損傷可激活DNA復(fù)制檢測(cè)點(diǎn)ATR、Chk1、Wee1調(diào)節(jié)，使細(xì)胞周期阻滯在S期以便DNA修復(fù)，阻止了順鉑引起的細(xì)胞死亡而產(chǎn)生耐藥。利用Wee1抑制劑或siRNA可引起DNA復(fù)制再燃，進(jìn)一步增加復(fù)制壓力和導(dǎo)致更多的DNA損害，最終使癌細(xì)胞死亡，同時(shí)使用順鉑和AZD-1775抑制劑治療三陰性乳腺癌，有望克服順鉑耐藥性并取得更好的治療效果［28］。miR-194表達(dá)在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)，在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-194過表達(dá)能抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和耐藥，而Wee1被證明是miR-194新的直接作用靶點(diǎn)，其過表達(dá)在一定程度上克服了miR-194抑制腫瘤的效果［29］。以上研究表明，Wee1抑制劑可降低腫瘤細(xì)胞耐藥性，抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，Wee1高表達(dá)者采用Wee1抑制劑與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤效果更佳，但其效果取決于DNA的修復(fù)狀態(tài)。

5小結(jié)

綜上所述，Wee1蛋白激酶在細(xì)胞周期S期和G2/M過渡期有重要作用，如在細(xì)胞DNA損傷時(shí)，可使細(xì)胞周期停滯以便受損的DNA修復(fù)。在多種腫瘤中由于Wee1蛋白激酶處于過表達(dá)狀態(tài)，抑制或下調(diào)Wee1蛋白激酶可引起有絲分裂災(zāi)難，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，Wee1蛋白激酶可能是理想的腫瘤治療靶點(diǎn)。Wee1蛋白激酶抑制劑AZD-1775聯(lián)合其他抗腫瘤藥物可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，取得更好的療效。雖然Wee1蛋白激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用機(jī)制尚未完全明了，但現(xiàn)有的研究結(jié)果為抗癌治療帶來了新的希望。

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