劉爽 張卓伯

自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)它在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)的方法對(duì)iPSC及其衍生物神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells NSC)移植治療腦梗死的方法、結(jié)論進(jìn)行概述，為干細(xì)胞移植治療腦梗死提供理論依據(jù)。

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral infarction)，是指因腦組織局部血液循環(huán)障礙，缺血缺氧引起的神經(jīng)功能障礙性疾病[1]。神經(jīng)細(xì)胞是一種永久細(xì)胞，一旦壞死后不可逆轉(zhuǎn)，腦梗死的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺損甚至威脅生命。腦梗死在我國(guó)的發(fā)病率很高，約為110/10萬(wàn)人口，腦梗死患者的病死率較高、生活質(zhì)量較差，對(duì)家庭和社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)較重。目前多采用藥物或介入手術(shù)治療，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種治療可以完全恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。近些年來(lái)科學(xué)發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞移植是一項(xiàng)新穎而有潛力的治療腦梗死的方法，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明移植入小鼠體內(nèi)的胚胎干細(xì)胞具有多分化性，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，并且具有高度的自我復(fù)制能力，替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞而發(fā)揮功能[2]。但是，由于胚胎干細(xì)胞需要使用胚胎細(xì)胞，存在倫理道德?tīng)?zhēng)議，且異體移植會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，所以研究受到了限制。2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)解決了這一問(wèn)題，日本Yamanaka[3]研究小組利用Oct3/4、Sox2、C-Myc 和Klf4 4種轉(zhuǎn)錄因子重新編碼小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，成功獲得了生物特性與胚胎干細(xì)胞非常相似的細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

iPSC相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞重編程手段具有極大的優(yōu)勢(shì)。(1)iPSC受體細(xì)胞可來(lái)自體細(xì)胞，不需要使用卵母細(xì)胞或胚胎，可避免倫理及免疫排斥兩大問(wèn)題；(2)來(lái)源廣泛。可以取自人B淋巴細(xì)胞[4]、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞[5]、神經(jīng)細(xì)胞[6]等多種組織器官；(3)操作簡(jiǎn)單，具有重復(fù)性。取材可以來(lái)自患有特定疾病的患者，從而實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化。例如可以取來(lái)自于患神經(jīng)退行性疾病患者的皮膚細(xì)胞，如肌萎縮側(cè)索硬化癥或帕金森氏病[7]，分化提取所需要的細(xì)胞類型，如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元[8]，這使得人們?cè)谘芯考膊“l(fā)展的細(xì)胞和分子水平上達(dá)到了一個(gè)新高度；(4)增殖能力高。許多類型的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞只能進(jìn)行有限數(shù)量的增殖，而重新編程后得到的iPSC仍然是二倍體細(xì)胞。這讓iPSC技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的重編程手段, 向臨床應(yīng)用更近一步。

1 iPSC和NSC應(yīng)用于治療腦梗死

腦梗死與其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病不同，腦缺血發(fā)生后血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元都在一定程度上發(fā)生了破壞和死亡，因此與帕金森病只需要一種細(xì)胞不同，治療腦梗死需要細(xì)胞移植后分化的細(xì)胞種類更多,但是腦梗死是一次性的腦組織缺血損傷而非退行性改變，已經(jīng)缺血壞死的腦組織不會(huì)再持續(xù)的退化，因此細(xì)胞移植治療腦梗死不需要再進(jìn)行基因修飾和重新編碼。Jiang等[9]在小鼠模型上初步完成了iPSC治療腦梗死的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估治療的效果及風(fēng)險(xiǎn)，雖然移植后小鼠的功能得到了改善，但發(fā)現(xiàn)大量的iPSC細(xì)胞經(jīng)移植后死亡，只有少量細(xì)胞存活，且存在高致瘤性的問(wèn)題。有報(bào)道稱經(jīng)顱內(nèi)直接注射細(xì)胞較硬膜下腔注射的方法導(dǎo)致畸胎瘤的概率增高。有研究將纖維蛋白膠與iPSC混合后移植入腦梗死小鼠的硬膜下腔，觀察到小鼠的功能改善，梗死面積縮小，且在6周后未發(fā)現(xiàn)腫瘤的形成，說(shuō)明纖維蛋白膠可以一定程度上降低腫瘤發(fā)生的概率[10]。

由于iPSC的較高致瘤性和較低存活率，將未分化的iPSC直接用于治療腦梗死是不可行的，而移植后的iPSC需要先分化為神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells NSC)，才能進(jìn)一步分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，生理?xiàng)l件下人的腦組織側(cè)腦室的腦室下層及海馬齒狀回粒內(nèi)含有一定量的神經(jīng)干細(xì)胞，這些細(xì)胞以膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)存在而不發(fā)揮功能，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)這些神經(jīng)干細(xì)胞受到環(huán)境因素中某些信號(hào)因子的影響遷移、分化為神經(jīng)元而發(fā)揮功能。移植的NSC具有弱免疫原性的特點(diǎn)，進(jìn)行細(xì)胞移植后很少發(fā)生免疫排斥的現(xiàn)象。此外，NSC的趨化性較強(qiáng)，由于微環(huán)境的作用，移植入體內(nèi)后可向病灶處遷移、增殖、分化。因此，有研究將iPSC-NSC移植應(yīng)用于治療腦梗死[11]，目前已有多種方法可在體外成功地將iPSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞[12-14]。有研究將人類iPSC-NSC移植到腦缺血大鼠的紋狀體，并使用MRI追蹤發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)注射區(qū)域沿著胼胝體遷移至腦梗死區(qū)域，與宿主細(xì)胞發(fā)生整合，取代受損的細(xì)胞重建神經(jīng)環(huán)路[15]。此外，神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可能還有以下機(jī)制：(1)NSC分化為多種類型的成熟神經(jīng)元、星狀細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，修復(fù)、替代梗死后缺損的神經(jīng)細(xì)胞；(2)改變微環(huán)境，產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor)等促進(jìn)損傷修復(fù)作用的營(yíng)養(yǎng)因子[16]；(3)減少了炎癥反應(yīng)的發(fā)生、抑制了膠質(zhì)細(xì)胞的增生，且促進(jìn)了室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和遷移，整體提高了神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)能力；(4)通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor)和促血管生成素的生成，從而促進(jìn)新生血管的形成，為神經(jīng)功能的恢復(fù)提供充足的血供[17]。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明無(wú)腫瘤細(xì)胞形成。Oki等[8]人將在體外獲得的iPSC-NSC移植到腦梗死小鼠模型的紋狀體，10周后發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞存活率是10%。Oki等人在10只裸鼠身上再次重復(fù)這個(gè)試驗(yàn)，48 h后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的移植，4個(gè)月后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率為50%，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)72%的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元抗體，6%的細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗體，2個(gè)月后2只小鼠死亡，8只存活，4個(gè)月后4只小鼠死亡，6只存活，所以移植后2個(gè)月的存活率為80%，4個(gè)月為60%；4個(gè)月后77%的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元抗體，5%的細(xì)胞表達(dá)紋狀體細(xì)胞的標(biāo)志物—多巴胺能和cAMP相關(guān)的神經(jīng)元磷蛋白(DARPP)-32，這個(gè)百分比與細(xì)胞直接移植到紋狀體后，存活的機(jī)率大致相同。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著進(jìn)行移植的部位(例如皮層、紋狀體)不影響細(xì)胞最終的存活，而在體外將iPSCs分化為神經(jīng)干細(xì)胞再進(jìn)行移植比直接使用iPSCs更能提高細(xì)胞的存活率。

目前iPSC的應(yīng)用存在最大的問(wèn)題就是在基因整合的過(guò)程中腫瘤的發(fā)生，目前導(dǎo)致iPSC成瘤的因素還未明確。Riggs等[18]發(fā)現(xiàn)iPSCs與惡性肉瘤有部分細(xì)胞類型相同，在沉默基因與代謝活性方面存在某些共性，認(rèn)為iPSC與癌細(xì)胞十分相似，腫瘤發(fā)生的原因可能就在于此。Park等[19]認(rèn)為使用病毒作為載體將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生基因突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Mohammad等[20]用無(wú)病毒載體和無(wú)外源基因的編程方法誘導(dǎo)出iPSC，再將這些細(xì)胞分化成為神經(jīng)干細(xì)胞，并將這些細(xì)胞移植到腦梗死發(fā)生7 d后的實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)，通過(guò)移除黏附物能力測(cè)試，測(cè)試到小鼠恢復(fù)了感知功能，且腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也相應(yīng)的增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及突觸的形成，12個(gè)月后測(cè)試無(wú)腫瘤形成。為了去除iPSC中的致腫瘤基因，Liu等[21]也使用相同的方法在缺氧的條件下僅使用2個(gè)因子將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染為iPSC，并將其誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞注入腦缺血小鼠模型，小鼠的神經(jīng)功能缺損也得到了改善，且無(wú)腫瘤形成。Thier等[22]使用最新的技術(shù)，成功地激活了Oct4將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSC，這種方法與傳統(tǒng)的iPSC技術(shù)相比生產(chǎn)速度提高了2～3倍，且細(xì)胞的致瘤性也得到了降低。有實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)移植宿主存在免疫缺陷時(shí)會(huì)增加致瘤的風(fēng)險(xiǎn)[23]。

由于腦梗死的發(fā)病年齡老年化，因此Tatarishvili等[24]在24個(gè)月齡的大鼠身上完成了細(xì)胞移植治療腦梗死的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞移植8周后49%的細(xì)胞分化為成熟的γ氨基丁酸神經(jīng)元，圓筒實(shí)驗(yàn)證明小鼠缺損的神經(jīng)功能明顯得到改善，且減少了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。目前大多數(shù)已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)都使用的是健康雄性鼠，將來(lái)還需要在雌性鼠及一些合并其他疾病的鼠身上開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，如高血壓病、糖尿病等，這些都是腦梗死的危險(xiǎn)因素[22]。

2 移植的時(shí)間窗和劑量

iPSC-NSC移植的重要問(wèn)題之一就是腦梗死發(fā)生后細(xì)胞移植的時(shí)間，以往胚胎細(xì)胞移植的經(jīng)驗(yàn)提示大腦中動(dòng)脈閉塞致腦梗死發(fā)生后在第48 h移植細(xì)胞的存活率最高[25]，Shear等[26]認(rèn)為腦梗死發(fā)生后第2～7 d為神經(jīng)干細(xì)胞移植的最佳時(shí)間，而非在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)之前移植可能與急性期局部腦組織壞死、細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)增高有關(guān)，且急性期的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子較少，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是在腦梗死發(fā)生后第48 h這一時(shí)間點(diǎn)移植在臨床實(shí)施上比較困難，制備一定量的iPSC至少需要4周，再將其誘導(dǎo)為需要的神經(jīng)干細(xì)胞又需要幾周，而將這些細(xì)胞應(yīng)用于臨床前還需要經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，確保其安全性。因此，以現(xiàn)在的制備技術(shù)達(dá)到時(shí)間窗的要求還十分的困難。

目前就腦梗死細(xì)胞移植劑量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)還十分匱乏，大部分的數(shù)據(jù)主要來(lái)自鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，Darsila等[27]分別將3×105、7.5×105和15×105數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞移植到腦梗死小鼠模型的腦內(nèi)，結(jié)果顯示當(dāng)移植細(xì)胞數(shù)超過(guò)3×105的時(shí)候，細(xì)胞的存活率將不再隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增加，提示3×105數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞可以以最小的數(shù)目發(fā)揮較好的治療效果。Wang等[28]認(rèn)為8×105數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞治療腦梗死的Wistar大鼠為最佳數(shù)目。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)還沒(méi)有在與人類腦體積和構(gòu)造相似的大型動(dòng)物身上實(shí)踐過(guò)，所以應(yīng)用人體的細(xì)胞數(shù)量可否依據(jù)這些實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)據(jù)成比例計(jì)算還不明確。

3 展 望

目前對(duì)iPSC的定向誘導(dǎo)和神經(jīng)干細(xì)胞的移植治療腦梗死實(shí)驗(yàn)研究已有很多，但還都停留在探索階段，以iPSC為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法在治療腦梗死方面存在著巨大的潛力，但還有很多問(wèn)題亟待明確，如iPSC的致瘤性、神經(jīng)干細(xì)胞移植的數(shù)量、時(shí)間、部位(缺血半暗帶內(nèi)還是梗死區(qū)域)。為了保證iPSC和NSC的質(zhì)量和減少制備時(shí)間，將來(lái)需要建立統(tǒng)一來(lái)源的iPSC細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù)，提供優(yōu)質(zhì)來(lái)源細(xì)胞，增加移植后的安全系數(shù)，使細(xì)胞移植治療腦梗死應(yīng)用于臨床早日實(shí)現(xiàn)。

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