王 惠,趙 蓉,周學(xué)中

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康,2013年全球因心血管疾病而死亡的人數(shù)達(dá)到1 730萬(wàn),占總死亡人數(shù)的31.5%[1].隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活方式的變化,心血管疾病患病人數(shù)仍在快速增長(zhǎng)[2].近年來(lái),隨著對(duì)心血管疾病致病基因和分子基礎(chǔ)的探索,人們已經(jīng)提出了藥物和基因治療等方法緩解心血管疾病的一些癥狀[3].由于給藥方式的選擇為臨床治療和科學(xué)研究考慮的主要問(wèn)題之一[4-5],本研究通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行心肌層注射方法的建立與優(yōu)化,試圖提出一種穩(wěn)定有效的注射方式.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specif i c pathogen free,SPF)級(jí)C57BL/6小鼠,雌雄均可,由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供.操作依照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(National Institutes of Health)的相關(guān)規(guī)定.

1.1.2 注射用藥物

質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的Evans Blue(Sigma);帶GFP的慢病毒(1×109TU/mL);質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

小動(dòng)物呼吸機(jī)、體視顯微鏡、光源、加熱墊、電子天平.

顯微外科手術(shù)器械:蚊剪、直鑷、彎鑷、顯微尖鑷、顯微彎鑷、高壓滅菌鍋、4-0手術(shù)縫合線、紗布、碘伏棉棒.

胰島素注射器,由美國(guó)BD公司提供;針頭規(guī)格29 G,透明膠帶.

冰凍切片機(jī)、OCT包埋劑(optimal cutting temperature compound)、熒光顯微鏡.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠心肌層注射

手術(shù)操作過(guò)程如圖1所示,具體操作步驟如下.

圖1 小鼠心肌層注射的手術(shù)過(guò)程Fig.1 Surgical procedure of myocardial layer injection in mice

第1步 高壓滅菌手術(shù)器械,準(zhǔn)備手術(shù)區(qū)域,手術(shù)區(qū)域用75%的酒精擦拭消毒.

第2步 設(shè)置熱毯溫度恒定為34°C,且在手術(shù)期間保持小鼠正常的體溫.設(shè)置呼吸機(jī)頻率120次/min,潮氣量2.0,確定小動(dòng)物能夠呼吸順暢.

第3步 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行稱重,然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠.

第4步 將小鼠置于34°C恒溫墊,暴露小鼠頸部和胸部,用脫毛膏脫去頸部和左胸口毛發(fā).

第5步 小鼠取仰臥位,用碘伏棉棒消毒手術(shù)區(qū)域3遍,鑷子夾持小鼠尾巴,觀察其反射程度確定小鼠是否充分麻醉.

第6步 在顯微鏡下沿直線分離覆蓋氣管上的頸部皮膚、肌肉及組織,暴露氣管后,在聲門(mén)下兩個(gè)氣管軟骨環(huán)之間切一個(gè)小孔,插入氣管插管,固定,檢查胸廓的運(yùn)動(dòng),確保兩肺通氣良好,呼吸頻率為120次/min.

第7步 開(kāi)胸.在顯微鏡下使用顯微剪將小鼠胸骨左緣第四第五肋間位置做一橫形切口,切口長(zhǎng)約1.2 cm,逐層分離胸壁肌肉直至肋間肌暴露,使用顯微鑷鈍性分離肋間肌肉,暴露心臟.

第8步 心肌注射.使用1 mL的胰島素針吸取藥物或者慢病毒稀釋液一小格,即25μL,針尖垂直向下扎進(jìn)心臟左心室的心室壁肌肉,扎入深度為剛沒(méi)過(guò)針尖切面為標(biāo)準(zhǔn);然后緩慢將藥物推出,拔出注射器.

第9步 逐層縫合關(guān)閉實(shí)施手術(shù)區(qū)域.

第10步 對(duì)術(shù)后傷口進(jìn)行碘酒消毒,若小鼠有脫水跡象,及時(shí)腹腔注射無(wú)菌生理鹽水.

第11步 小鼠置于熱毯恢復(fù),直到自行爬動(dòng),然后拿開(kāi)熱毯,將小鼠放回鼠籠.

在心肌層注射過(guò)程中,針頭進(jìn)入的深度較難控制.進(jìn)針太深會(huì)注射入心腔,藥物和病毒無(wú)法進(jìn)入心肌,同時(shí)心臟出血,死亡率增加;若進(jìn)針太淺,藥物和病毒無(wú)法注射進(jìn)入心肌層,實(shí)驗(yàn)失敗率增加.另外,注射的深淺不同,對(duì)心臟的損傷程度不一致,無(wú)法保證穩(wěn)定性.基于此,采用無(wú)菌的透明膠帶對(duì)針頭進(jìn)行處理,以此控制進(jìn)針的深度并保證實(shí)驗(yàn)的均一性.對(duì)于不同種類(lèi)的動(dòng)物,比如大鼠,可以統(tǒng)一固定調(diào)整進(jìn)針的深度.注射針頭的處理和效果如圖2所示.

圖2 改進(jìn)后的小鼠心肌層注射針頭Fig.2 Improved syringe of myocardial layer injection in mice

1.2.2 冰凍切片與熒光拍攝

冰凍切片與熒光拍攝的操作步驟如下.

第1步 取心臟組織.腹腔注射質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,再用顯微剪在小鼠腹部做橫切口;然后由兩側(cè)垂直往上延伸直至膈肌顯露,最終露出心臟;彎鑷從心臟下方走行,夾住主動(dòng)脈等大血管將心臟小心上提;用顯微剪在彎鑷下方離斷血管,取出心臟并置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buあer saline,PBS)中;最后用顯微鑷輕輕擠壓心臟,去除血液.

第2步 OCT包埋劑包埋.將取出的新鮮心臟組織用OCT包埋劑浸潤(rùn);然后迅速放入液氮中,快速冷卻;最后置于?80°C冰箱中保存.

第3步 切片.預(yù)冷冰凍切片機(jī)至?20°C,然后將樣品托涂上OCT包埋劑,并將樣品置于其上,冰架上冷卻30 min;調(diào)整角度、厚度,修片后切片,取10μm;切好的切片置于?80°C冰箱保存.

第4步 熒光采集.將切好的冰凍切片常溫復(fù)溫20 min,PBS清洗,洗凈OCT包埋劑后,置于熒光顯微鏡下采集照片.

2 結(jié)果

2.1 注射藥物和慢病毒效果

向心肌層分別注射Evans Blue染料和慢病毒,注射完畢后,置于體視鏡下觀察,結(jié)果如圖3和4所示.由圖可以看出:注射Evans Blue染料后,注射點(diǎn)附近的心肌層被染成藍(lán)色,并且向四周暈開(kāi);注射慢病毒后,注射點(diǎn)附近的心肌層出現(xiàn)白色區(qū)域.上述結(jié)果表明藥物和慢病毒均可注射入心肌層,并且小鼠存活率高.

圖3 小鼠心肌層注射Evans Blue染料后的效果圖Fig.3 Diagram of Evans Blue injection of myocardial layer injection in mice

圖4 小鼠心肌層注射慢病毒后的效果圖Fig.4 Diagram of lentivirus injection of myocardial layer injection in mice

2.2 慢病毒注射后的基因表達(dá)

選取帶綠色熒光蛋白(green f l uorescent protein,GFP)的慢病毒進(jìn)行心肌層注射,并在注射一周后檢測(cè)GFP的表達(dá)情況,結(jié)果如圖5所示,其中1表示注射慢病毒的位置,標(biāo)尺長(zhǎng)度為100μm.由圖可以看出,在注射點(diǎn)附近的不同位置均可以檢測(cè)到GFP的表達(dá),并且在其他組織中無(wú)法檢測(cè)到GFP的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示).

圖5 小鼠心肌層注射慢病毒后GFP的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Result of GFP-f l uorescent detection after myocardial layer lentivirus injection in mice

3 討論

目前,心臟注射方式在一些研究中已經(jīng)得到了應(yīng)用,例如心內(nèi)注射外泌體[6]和miRNA(microRNA)物質(zhì)[7].但是心內(nèi)注射會(huì)導(dǎo)致注射的物質(zhì)隨著血液進(jìn)入體循環(huán),而真正停留在心臟中的物質(zhì)會(huì)偏少,影響干預(yù)效率.心肌層注射能夠使絕大多數(shù)注射的物質(zhì)保留在心臟中,特別是對(duì)于一些心梗區(qū)域的干預(yù)具有比較明顯的優(yōu)勢(shì).本研究明顯地顯示出注射的藥物能夠停留在心肌層內(nèi)部.但是,心肌層注射最大的困難在于控制注射針頭的深度:若注入較深,注射物質(zhì)會(huì)進(jìn)入心腔,并且隨著血液循環(huán)而喪失,容易出現(xiàn)心臟出血,從而影響小鼠的存活率;若注射太淺,注射物質(zhì)不易進(jìn)入心臟,無(wú)法發(fā)揮注射藥物的效率.本研究通過(guò)對(duì)胰島素注射器進(jìn)行改良,加入可以控制進(jìn)針深度的原件,較好地解決了這一問(wèn)題,提高了手術(shù)的穩(wěn)定性和均一性.

目前,在心血管研究中腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)憑借其比較高的安全性已被大家認(rèn)可[8].不同的血清型對(duì)不同的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異,例如AAV1,AAV6,AAV8和AAV9對(duì)心臟具有很好的親和性.特別是,AAV9可通過(guò)尾靜脈等常用的注射方式進(jìn)行感染心臟組織[9].通過(guò)尾靜脈注射,AAV9一方面大量進(jìn)入心臟組織[10],另一方面還會(huì)進(jìn)入腦組織[11]、肺組織[12]、肝臟組織[13]等器官,這不可避免地影響實(shí)驗(yàn)或者基因治療的結(jié)果.因此,心肌層注射成為優(yōu)秀的注射方案之一.本研究表明,心肌層注射可以較好地保證注射的物質(zhì)停留在心臟組織并且能夠長(zhǎng)期的表達(dá),而不影響其他器官.這為基因治療提供了一種比較有效的注射方式.

綜上所述,本研究提出的心肌層注射方式為心血管研究和心血管基因治療方案的選擇提供了一定的幫助與借鑒.

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