張守路 饒力群 汪啟明

摘要 轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，在緩解資源匱乏、提高糧食產(chǎn)量、保護(hù)生態(tài)環(huán)境安全、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面做出巨大貢獻(xiàn)。RNAi是迅速發(fā)展起來的一種新興基因阻斷技術(shù)，近年來，在作物防治病蟲害和品質(zhì)改良方面取得了顯著成效，商業(yè)化應(yīng)用已成為現(xiàn)實(shí)。因此，基于RNAi的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)現(xiàn)狀越來越受到人們的關(guān)注。本文就已產(chǎn)業(yè)化的RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品、RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研究進(jìn)展及對RNAi轉(zhuǎn)基因作物安全評價(jià)研究展望進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞 核酸干擾技術(shù)；轉(zhuǎn)基因作物；基因沉默；安全評價(jià)

中圖分類號 S188；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）21-0003-02

Advances in Research and Development of Genetically Modified Crops Based on RNAi

ZHANG Shou-lu RAO Li-qun WANG Qi-ming *

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract As an important part of modern biotechnology，genetically modified technology has made great contributions to alleviating resource shortage，increasing food production，protecting ecological environment and expanding agricultural functions. RNA interference（RNAi）is an emerging genetic blocking technology which developed rapidly. In recent years，remarkable achievements have been made in crop pest control and quality improvement，and commercial application has become a reality. Therefore，the research and development status of RNAi-based transgenic crops has attracted more and more attention. In this paper，the research progress of the industrialized RNAi transgenic products，RNAi transgenic plants and the safety evaluation research prospects of RNAi genetically modified crops were summarized.

Key words RNA interference technology；genetically modified crop；gene silencing；safety evaluation

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)同源mRNA高效特異性降解，從而使特定基因表達(dá)受抑制或使其沉默的現(xiàn)象[1]。雙鏈RNA（dsRNA）是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）的降解。在ATP作用下，經(jīng)過Dicer酶（一種具有RNAaseⅢ活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的dsRNA（30 bp以上）首先被降解形成21～25 bp的小分子干擾核糖核酸（short interfering RNA，siRNA），并有效地定位目標(biāo)mRNA。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5′端磷酸基團(tuán)和3′端的羥基，其2條鏈的3′端各有2個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。

RNAi技術(shù)具有序列的高度特異性、抑制基因表達(dá)的高效性、沉默信號的高穩(wěn)定性、沉默信號的可遺傳性和可傳遞性的特點(diǎn)。

1 已商業(yè)化應(yīng)用的RNAi轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品

RNAi以其序列特異性的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于阻斷或抑制基因表達(dá)，這也使得它成為轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)的強(qiáng)大工具。RNAi作為新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在植物抗病蟲害和品質(zhì)改良等方面得到了廣泛應(yīng)用，一批RNAi轉(zhuǎn)基因植物開始商業(yè)化應(yīng)用。

1.1 基于RNAi的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品

由于Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因作物大面積連年種植，害蟲產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗性。因此，研發(fā)新的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物刻不容緩。以表達(dá)V-ATPase dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米喂養(yǎng)玉米根蟲，發(fā)現(xiàn)根蟲的該基因表達(dá)量下降，玉米根部受損程度明顯降低[2]；當(dāng)以表達(dá)CYP6AE14 dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草喂養(yǎng)棉鈴蟲時(shí)，該基因在蟲體中腸里的表達(dá)量下降，幼蟲生長發(fā)育減緩[3]。此外，棉鈴蟲取食在棉花中表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶后更易吸收dsRNA[4]。另外，發(fā)現(xiàn)參與膜受體運(yùn)輸?shù)腟nf7基因在玉米根蟲的防治上效果更顯著，孟山都公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米MON87411含有玉米根蟲DvSnf7基因的dsRNA，根蟲取食該轉(zhuǎn)基因玉米后體內(nèi)的基因就會被DvSnf7 dsRNA靶向結(jié)合并干擾，進(jìn)而致死[5]。轉(zhuǎn)基因玉米MON87411已在美國、巴西、日本等8個國家和地區(qū)通過轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)，并已向我國申請進(jìn)口安全證書。

我國在轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)的支持下，RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)也取得了很大進(jìn)展。中國科學(xué)院微生物研究所通過RNAi抑制棉花黃萎病原真菌大麗輪枝菌中致病基因的表達(dá)，開發(fā)了抗黃萎病棉花，抗性較對照處理提高了20%以上[6]；中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)通過RNAi技術(shù)阻斷棉鈴蟲保幼激素合成，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花，尤其對于Bt抗性棉鈴蟲品系有很好的防治效果[7]。

1.2 基于RNAi的品質(zhì)改良轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品

蘋果、馬鈴薯等果蔬在生產(chǎn)、貯藏、加工等過程中經(jīng)常出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，產(chǎn)生異味，損失營養(yǎng)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，植物組織的褐變與多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）有關(guān)，抑制多酚氧化酶活性可以減弱作物的褐變程度。奧卡諾根特色水果公司利用RNAi技術(shù)抑制蘋果體內(nèi)多酚氧化酶基因（PGAS PPO suppression gene），研發(fā)了轉(zhuǎn)基因蘋果GD743等3個轉(zhuǎn)化體，能減緩蘋果褐化，已在美國和加拿大通過了轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)并已商業(yè)化應(yīng)用；辛普勞公司利用RNAi技術(shù)抑制asn1和ppo5基因，研發(fā)了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯E12，能夠減少黑斑，降低致癌物質(zhì)丙烯酰胺的含量，已在美國、加拿大、澳大利亞等5個國家通過轉(zhuǎn)基因安全評價(jià)和商業(yè)化應(yīng)用。利用RNAi技術(shù)降低支鏈淀粉等物質(zhì)含量，改良作物品質(zhì)，已在玉米、水稻、小麥等作物中得到廣泛應(yīng)用，獲得了一系列有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的轉(zhuǎn)基因材料。

可見，RNAi已成為新型轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)的重要類型，既有國外產(chǎn)品陸續(xù)問世并期望進(jìn)入我國市場，國內(nèi)自主研發(fā)的RNAi轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也不斷出現(xiàn)。

2 RNAi轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)進(jìn)展

2.1 特異轉(zhuǎn)化體構(gòu)建

RNAi是轉(zhuǎn)入的非編碼的核酸序列，其發(fā)揮作用是依靠影響靶基因的表達(dá)而體現(xiàn)出來的，涉及到對靶基因表達(dá)的干擾效果以及非靶標(biāo)的影響等方面。要綜合考慮不同靶位點(diǎn)、不同干擾片段劑量和不同檢測時(shí)間的干擾效果進(jìn)行構(gòu)建特異轉(zhuǎn)化體。楊中俠等[8]通過對比試驗(yàn)構(gòu)建了70 nL劑量CAD1位點(diǎn)對應(yīng)的dsRNA注射到幼蟲體內(nèi)48 h后干擾效果最佳的RNAi沉默小菜蛾類鈣粘蛋白基因體系。李 嬌等[9]成功構(gòu)建了注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ靶位點(diǎn)2種dsRNA 1.5 ng劑量，在96 h后作用最強(qiáng)的沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的體系。張淑靜等[10]構(gòu)建了注射針對vatp1亞基位點(diǎn)合成的dsRNA 100 nL劑量，在72 h后，V-ATPase H亞基mRNA表達(dá)幾乎被完全抑制的沉默東方粘蟲V-ATP酶H亞基的體系。Zha等[11]利用RNAi轉(zhuǎn)基因水稻靶向表達(dá)褐飛虱中腸里高表達(dá)的Nltry、Nlcar和NIHT1這3個基因的dsRNA，發(fā)現(xiàn)褐飛虱在進(jìn)食這種轉(zhuǎn)基因水稻之后發(fā)生了RNAi效應(yīng)，最終表現(xiàn)為中腸里的這3個基因的表達(dá)量明顯下降。

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化方法

植物遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的篩選是植物基因工程的重要環(huán)節(jié)，目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中運(yùn)用較多的是載體法和外源目的DNA直接轉(zhuǎn)化法兩大類。其中，載體法主要包括農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒介導(dǎo)法、葉盤法、真空滲入法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)球法；另外，基于載體法，新的轉(zhuǎn)基因方法[12]有基于AC/DS轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)化載體、利用噬菌體P1Cre-lox位點(diǎn)的特異性重組系統(tǒng)、利用酵母線粒體I-SceI核酸內(nèi)切酶特異性誘導(dǎo)植物DNA雙鏈斷開引起的同源重組系統(tǒng)、利用雙元細(xì)菌人造染色體載體系統(tǒng)等，可以提高轉(zhuǎn)化率或轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)質(zhì)量。Liang等[13]構(gòu)建了由胚乳特異啟動子啟動的小麥籽粒PPO基因IR-RNAi載體（正義臂和反義臂之間插入了擬南芥FAD2的intron9），并已成功轉(zhuǎn)化小麥。

外源目的DNA直接轉(zhuǎn)化法包括基因槍法、化學(xué)藥劑誘導(dǎo)法、花粉管通道法，此外，其他遺傳轉(zhuǎn)化方法還有顯微注射法、激光微束穿刺法、多聚陽離子基因?qū)敕ǖ?，均在不同植物上有成功的?yīng)用。盧東長城[14]實(shí)驗(yàn)室用基因sbeIIb和sbeI的末端編碼區(qū)（約200 bp）、3′末端非編碼區(qū)（3′-untran-slatedregion，3′-UTR）構(gòu)建了2個Sense-RNAi載體和2個hpRNAi載體，用基因槍同時(shí)或分別轉(zhuǎn)化玉米，得到了穩(wěn)定遺傳的高直鏈淀粉轉(zhuǎn)基因玉米。

不管是載體法還是外源目的DNA直接轉(zhuǎn)化法，RNAi的載體與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因載體無明顯差異，使用時(shí)要根據(jù)不同植物、不同受體等多種因素選擇最佳方法。

2.3 轉(zhuǎn)化體篩選方法

目前，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定方法主要為利用標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定、分子檢測和免疫技術(shù)三大類。由于RNAi轉(zhuǎn)基因無表達(dá)蛋白，只能通過在DNA和RNA水平進(jìn)行檢測。孫重霞等[15]通過PCR、Southern雜交、半定量RT-PCR、Northern雜交、酶活篩選等分子檢測方法對RNAi抑制小麥籽粒PPO轉(zhuǎn)基因植株及其后代株系進(jìn)行篩選。張 燕等[16]同樣利用了RT-PCR、PCR方法對RNAi防治水稻條紋葉枯病植株進(jìn)行了鑒定。

3 RNAi轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的安全評價(jià)展望

隨著RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用的深入和RNAi轉(zhuǎn)基因作物逐漸商業(yè)化的推廣，RNAi轉(zhuǎn)基因技術(shù)所可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)和其產(chǎn)品的安全性也越來越受到人們的關(guān)注。對RNAi轉(zhuǎn)基因作物的安全評價(jià)尤為重要，但目前國內(nèi)尚無專門針對基于RNAi的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評價(jià)指南。因此，根據(jù)RNAi的轉(zhuǎn)基因特性，提出幾點(diǎn)建議。

3.1 非預(yù)期效應(yīng)的出現(xiàn)

相對于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物，RNAi轉(zhuǎn)基因植物的安全評價(jià)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物要更加關(guān)注dsRNA在植物細(xì)胞內(nèi)的插入位點(diǎn)、穩(wěn)定性和序列的特異性。明確插入位點(diǎn)在染色體上的準(zhǔn)確位置，確定是否會對體內(nèi)基因的表達(dá)造成影響。更長周期地觀察插入的干擾片段能否穩(wěn)定高效地表達(dá)和遺傳，建議至少跟蹤觀察規(guī)模種植后3代以上轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定性。由于核酸序列在生物體內(nèi)代謝的復(fù)雜性，需要更加全面和系統(tǒng)地比對特異RNAi干擾序列與植物基因組序列、生物圈相關(guān)生物體以及相關(guān)微生物基因組序列的互補(bǔ)情況，明確是否會影響非目標(biāo)基因的表達(dá)而對植物的生長代謝和品質(zhì)等造成影響。

3.2 對非靶標(biāo)生物的影響

RNAi轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲作用方式是通過昆蟲攝食進(jìn)入其體內(nèi)。因此，應(yīng)該建立農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性數(shù)據(jù)庫，明確接觸RNAi轉(zhuǎn)基因作物的生物種類，并且建立這些種類生物的基因組數(shù)據(jù)庫，了解與siRNA具有同源性序列的基因的表現(xiàn)型，以確定RNAi轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲活性譜[17]。明確RNAi轉(zhuǎn)基因作物是否會對土壤微生物產(chǎn)生影響，是否存在通過基因飄移siRNA影響其他作物的基因表達(dá)等。另外，RNAi轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品中雖然沒有外源蛋白質(zhì)的表達(dá)，但要按照現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因作物食用安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定dsRNA是否對人體生理功能產(chǎn)生影響。

4 結(jié)語

基因編輯CRISPR/Cas9利用同源重組可使特定基因功能完全失活，但存在脫靶效應(yīng)，且對于多倍體植物而言，基因組改造的難度很大。而RNAi操作較簡便，耗時(shí)較短，在不改變基因組DNA序列的情況下抑制或降低靶基因表達(dá)。盡管RNAi技術(shù)存在抑制效率不一致等不足，但作為一種高效、特異性的基因阻斷技術(shù)，在植物抗病蟲害、作物品質(zhì)改良及提升作物經(jīng)濟(jì)價(jià)值等領(lǐng)域的應(yīng)用愈發(fā)凸顯[18]。在以后RNAi轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的研發(fā)過程中應(yīng)確保干擾序列的特異性、精確控制dsRNA的劑量、杜絕對非靶標(biāo)基因的影響，讓RNAi 技術(shù)在生命科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

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