曹廣超 劉春雨 劉 穎 劉玉慧 李梓欣 王集會 史 磊

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；*山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355)

蜣螂是鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂CatharsiusmolssusLinnaeus的干燥全蟲，在全世界范圍分布十分廣泛。蜣螂性味咸寒，有毒，歸肝、胃、大腸經，被列為活血、散瘀、通腸化結、消腫解毒之品，具有定驚、破淤、通便、攻毒之功效,常用于驚癇癲狂、大便秘結、淋病、各種癌癥、肝脾腫大等病癥治療[1，2]。蜣螂作為藥用最早記載于《神農本草經》，而后在歷代本草中多有記載。現代藥理研究表明：蜣螂具有抗癌的功效[3，4]，蜣螂的醇提取物對人體肝癌細胞有抑制作用，其有效成份主要分布在腿部[5]。為深入研究蜣螂粉不同酶提取物在抗腫瘤方面的抑制效果。本文以蜣螂凍干粉為底物，采用4種蛋白酶進行水解，以蜣螂粉水提取物作為對照組，采用茚三酮法測定蛋白質的水解度并利用MTT法研究水提物對肺腺癌細胞A549的抑制效果，評價4種蛋白酶對蜣螂粉的水解效果，研究蜣螂粉水提物的抗腫瘤方面的藥效。

1 實驗材料

1.1 儀器

半微量凱式定氮儀；UV9100B分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；Memmert CO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑

胰蛋白酶(上海碧云天生物技術有限公司)；彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團試劑有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、無水乙醇(AR)、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)；MTT(武漢市蓋云天生物技術有限公司)；茚三酮(上海源聚生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司)。

1.3 藥材

本實驗所使用的蜣螂粉，購自山東臨沂市。(批號：20160701)

1.4 實驗細胞

肺腺癌A549細胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 方 法

2.1 蜣螂粉的酶解工藝

精密稱取蜣螂粉5份，每份1.000 0 g，分別置100 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶40加入定量蒸餾水，超聲提取20 min，按表1進行處理。抽濾后以3000 r/min離心10 min，定容至100 mL容量瓶得蜣螂酶解液。將酶解液平均分成兩份，一份用于蛋白質水解度的測定，另一份經干燥冷凍得凍干粉,用于做抗腫瘤藥理性試驗。

表1 四種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of four kinds of protease

2.2 氨基肽氮含量的測定

2.2.1茚三酮顯色劑的配制

精密稱取茚三酮0.5 g、果糖0.3 g、磷酸二氫鉀6 g、磷酸氫二鈉10 g，加入適量的蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，以做備用。

2.2.2標準曲線的繪制

精密稱取0.100 0 g干燥失重過的甘氨酸為標準品，加適量蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，然后取2 ml定容到100 mL容量瓶中，得到20 μg/mL的溶液。分別取1、2、3、4、5 mL加適量蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，配制濃度分別為2,4,6,8,10 μg/mL的標準溶液。分別從中取2 mL標準液于具塞試管中，加入1.00 mL新配制的顯色劑，同時做空白實驗，混合均勻后用沸水浴加熱15 min，冷水冷卻后加入5mL 40%的乙醇溶液，混合均勻后放置15 min，在570 nm波長處測定吸光度A，繪制其標準曲線。

2.2.3樣品含量測定

從“2.1”步驟中的5份蜣螂粉酶解液的容量瓶中，取適量定量地稀釋到適宜的濃度，按照“2.2.2”步驟中的方法測定樣品的吸光度A及繪制的標準曲線計算-NH2的含量，然后再乘以相應的稀釋倍數，可以得水解液中總-NH2肽氮的含量。

2.3 水解度的測定

水解度[6](Degree of Hydrolysis，簡稱DH)是指蛋白質水解過程中被裂解的肽鍵數與給定蛋白質總肽鍵數的比值。用茚三酮法按照2.2項下測定水解液中的游離氨基肽鍵含量和用半微量凱氏定氮法[7]測定原料中總氮量，同時設置空白對照組，再按下式計算水解度。

水解度(DH) % =已水解的肽鍵數/原料中總肽鍵數×100%=[( B-C) / ( A-C)]×100%

A：原料中的總氮數 B：水解液中的氨基氮數 C：原料中游離的氨基氮數

2.4 MTT法測定水解物對的抑制率

2.4.1提取物溶液的配制

精密稱取原藥材2%的蜣螂凍干粉，溶解于10 mL 1640培養(yǎng)液，配成含有效成分2 mg/mL的初始濃度，在無菌條件下用0.22 μm的濾膜進行過濾，然后用已濾菌的1640培養(yǎng)基依次進行稀釋，配成2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的藥物濃度梯度。

2.4.2細胞培養(yǎng)

①細胞復蘇[8]：從超低溫冰箱中取出凍存的肺腺癌細胞，迅速投入到預先加熱到37 ℃的滅菌水中，等待凍存液溶化，離心，收集細胞，然后用含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②接種：待細胞生長至80%融合時，以0.25%的胰酶細胞消化液(含0.02%EDTA)進行消化，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，預留三個調零孔，調零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4.3MTT法測定細胞抑制率

待96孔板中的細胞長滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調零組、空白對照組分別加入100 μl不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入100 μg/mL的順鉑100 μL，其他給藥組每孔分別加入不同濃度的藥物100 μL，每個濃度的藥物重復5個孔，其中以蜣螂水提液作為對照組。然后細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內避光反應4 h。吸去上清液，加入100 μl DMSO，用酶標儀在490 nm處測定OD值，按照下式計算藥物對細胞的抑制率。

細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調零組)/(空白組OD-調零組)]×100%

3 結 果

3.1 氨基肽氮含量的測定

3.1.1標準曲線的繪制

在測定氨基酸肽氮的含量時，茚三酮法是一種非常靈敏的常用方法，用此方法與甘氨酸標準溶液顯色后，用紫外分光光度計在570 nm波長處測定一定濃度梯度的甘氨酸標準溶液的吸光度A，然后以吸光度A為橫坐標，甘氨酸標準溶液的質量M1(μg)為縱坐標，繪制標準曲線回歸方程為M1=22.017A+0.0452,r2=0.9993，又因甘氨酸的相對分子質量為75.07，所以以吸光度為橫坐標，以-NH2的質量M2(μg)為縱坐標，其回歸方程為M2=46.925A+0.0964,r2=0.9993。

3.1.2樣品含量測定結果見表2

表2 水解液中氨基肽氮的含量Table 2 Content of amino nitrogen in Hydrolysate

由表2的數據可知胰蛋白酶對蜣螂粉酶解水提液中-NH2的含量最高，其次是彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶水提液-NH2的含量最少。

3.2 樣品水解度的測定

采用半微量凱氏定氮法測定1.000 0 g蜣螂粉中總氮量為29.57 mg。根據2.3下的水解度測定公式計算得出四種蛋白酶的水解度如圖1所示。

如圖1可知胰蛋白酶的水解度最大，DH=24.98%，其次是彈性蛋白酶DH=24.03%，胰凝乳蛋白酶DH=22.16%，胃蛋白酶的水解度最小，DH=13.95%。

圖1 四種蛋白丁敏的水解度Fig 1 Hydrolysis degree of four kinds of proteases

3.3 MTT法測定樣品對肺腺癌細胞A549的抑制率

不同濃度梯度下5種蜣螂粉水提液對肺腺癌細胞A549的抑制率曲線如圖2所示。橫坐標為不同藥物的濃度(mg/ml)，縱坐標為水解液對A549的抑制率(%)。由圖可知彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解液對肺腺癌A549細胞有明顯的抑制作用，且抑制率曲線呈上升趨勢，即抑制率隨濃度的增大而增大，而且抑制率顯著低于蜣螂粉水解液對照組。胃蛋白酶水提液對肺腺癌A549細胞幾乎沒有抑制作用。

圖2 5種蜣螂水解液對乳腺癌MFC-7細胞的抑制曲線Fig 2 Inhibition curves of 5 kinds of Catharsius hydrolysate on on lung adenocarcinoma A549

4 討 論

經研究表明，酶解提取工藝在中藥領域具有廣泛的應用，具有提取效果較好，周期短，反應溫和等優(yōu)點。本次實驗利用四種不同的酶將蜣螂粉酶解，在測定水解度的基礎上，進一步采用MTT法來檢測抗腫瘤活性。結果表明，胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解度分別為26.62%、24.99%、21.76%，在較低藥物濃度下，酶解蜣螂粉對肺腺癌A549無明顯抑制作用，而在較高濃度下，酶解蜣螂粉對肺腺癌A549的抑制率大小中，胰凝乳蛋白酶>彈性蛋白酶>胰蛋白酶。其次在用MTT法測定5種蜣螂提取物對肺腺癌細胞A549的抑制率試驗中，酶解液對肺腺癌A549的抑制效果均低于未酶解的水提液，酶解蜣螂的藥理性活性顯著降低的原因可能是：發(fā)生藥理活性的物質不同。與酶解其他中藥蟲類藥物不同的是在酶解中藥蜣螂時，使蜣螂的大分子蛋白降解為小分子的多肽、寡肽，使能發(fā)揮藥理活性的大分子蛋白遭到破壞，進而藥理活性降低。

本研究表明，水解度與抗腫瘤活性無直接相關性，因為酶解相當于在體外模仿人體胃腸道對藥物的作用效果因此說明以中藥蜣螂粉為有效成分的藥物，經口服后在對肺腺癌A549的治療上無顯著的作用。為下一步蜣螂抗腫瘤活性成分及蜣螂加工方法的改進提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

[1] 謝宗萬.全國中草藥匯編(上冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:910．

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[3] Ahn MY，Hahn BS，Ryu KS,et al.Purification and characterization of a serine protease: (CPM-2) with fbrinolytic activity from thedung beetles[J].Arch Pharm Res,2005,28(7) : 816～822．

[4] 趙興梅,朱敏,楊明,等.蜣螂抗實驗性前列腺增生作用研究[J].中藥藥理與臨床,2006,22(5) :37～38．

[5] 劉純益.關于昆蟲抗癌物質的研究概況[J].昆蟲知識,1979,16(4) :182．

[6] 趙新淮,馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定[J].食品科學,1994,(11):65～67.

[7] 中國藥典2010年版.一部[S].2010:附錄53～54.

[8] 司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版公司,1996:138．