陶 鑫 袁 紅 焦丹丹

(常州寅盛藥業(yè)有限公司，江蘇 常州 213003；*蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

慢性丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)引起的一種傳染性疾病。目前國(guó)際國(guó)內(nèi)研究較多的為NS5A、NS5B、NS3/4這三個(gè)靶點(diǎn)，針對(duì)NS4B的小分子抑制劑的開發(fā)起步較晚，目前沒有相關(guān)的藥物在臨床研究階段。2008年，斯坦福大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)HCV NS4B抑制劑克立咪唑(Clemizole)，該化合物可通過干擾NS4B的富精氨酸區(qū)域(arginine rich motif, ARM)與病毒負(fù)鏈RNA的相互作用而抑制病毒的復(fù)制[1]。但由于化合物明顯的細(xì)胞毒性及細(xì)胞水平的低活性(基因型2a復(fù)制子EC50=8μM)，使其終止于Ⅰ期臨床。在2010年，斯坦福大學(xué)的研究人員報(bào)道了另一個(gè)NS4B抑制劑Anguizole，該化合物可通過與蛋白質(zhì)第二個(gè)雙親螺旋(4BAH2)作用，抑制脂質(zhì)囊泡的聚集，從而抑制病毒的復(fù)制[2,3]。隨后，以此結(jié)構(gòu)出發(fā)，葛蘭素史克進(jìn)行大量的結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)了高活性的NS4B抑制劑[4,5]，而在2013年，PTC[6,7]、Pharmasset[8]及Gilead公司[9]也相繼報(bào)道了具有相同機(jī)制的NS4B抑制劑。但這些藥物由于口服吸收差等問題均已停止臨床開發(fā)。

我公司開發(fā)的安非合韋為苯并呋喃類的全新的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)NS4B抑制劑，該藥物已在中國(guó)獲批臨床并正在開展臨床試驗(yàn)。因此，安非合韋目前是針對(duì)丙肝NS4B靶點(diǎn)的唯一一個(gè)臨床階段的藥物，若獲批生產(chǎn)，將成為First-in-class的藥物。本文建立了安非合韋有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

安捷倫1260 液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器(G1314F)和DAD雙檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，EZChrom色譜工作站。安非合韋自制對(duì)照品(含量99.38%)，安非合韋(批號(hào)為201403-03-141207, 201403-03-141208，201403-03-141209，由常州寅盛藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；純化水；乙腈為色譜級(jí)；磷酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用Thermo BDS HYPERSIL C18(4.60×250 mm, 5.0 μm色譜柱，用等度洗脫的方式，流動(dòng)相0.1%磷酸水溶液∶乙腈=5∶5，照中國(guó)藥典高效液相色譜法的要求進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試為在平衡色譜系統(tǒng)后，基線應(yīng)有最小的噪音和漂移，按照空白1針，對(duì)照溶液(ST)5針，雜質(zhì)對(duì)照溶液(IMPST)1針，樣品溶液(SP)1針，對(duì)照溶液(ST)1針的順序進(jìn)行分析，對(duì)照溶液主峰的理論塔板數(shù)應(yīng)不得低于3000，對(duì)照溶液中主峰拖尾因子應(yīng)不大于2.0，六針對(duì)照溶液中主峰的峰面積RSD應(yīng)不大于2.0%。

2.2 溶液配制及檢測(cè)

取安非合韋供試品30 mg，精密稱定，放入100 mL容量瓶中，加稀釋液(乙腈∶水=5∶5)溶解并稀釋至刻度，混勻即得濃度為0.3 mg·mL-1樣品溶液。照色譜條件，自動(dòng)進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算。稀釋劑空白色譜圖譜見圖1，安非合韋樣品圖譜見圖2。

圖1 稀釋劑空白色譜圖Fig 1 Chromatogram of Blank

圖2 安非合韋樣品色譜圖Fig 2 Chromatogram of Amphihevir API

2.3 專屬性

稱取適量樣品，分別加入酸(1 mol/L鹽酸)、堿(1 mol/L氫氧化鈉)和氧化(30%雙氧水)1 mL，置80 ℃水浴中加熱1 h，取出冷卻至室溫，用稀釋液溶解并定容至刻度。分別稱取高溫(60℃)、高濕(92.5RH%)、強(qiáng)光(4 500 Lx±500 Lx)下5 d，10 d的適量樣品，用稀釋液溶解并定容至刻度。分別將6種不同條件破壞后制備的樣品按選定的色譜條件，進(jìn)樣10 μL，考察安非合韋的雜質(zhì)專屬性。結(jié)果顯示安非合韋與降解物質(zhì)均能較好的分離，且主峰峰純度均為0.95以上，沒有包裹雜質(zhì)。酸、堿、氧化破壞見色譜圖3～5，高溫、高濕和強(qiáng)光破壞10天的色譜圖見圖6～8。

圖3 安非合韋酸破壞(1 mol/L鹽酸)色譜圖Fig 3 Chromatogram of Amphihevir degraded by acid (1N hydrochloric acid solution)

圖4 安非合韋堿破壞堿(1 mol/L氫氧化鈉)色譜圖Fig 4 Chromatogram of Amphihevir degraded by alkali (1N sodium hydroxide solution)

圖5 安非合韋氧化破壞堿(30%雙氧水)色譜圖Fig 5 Chromatogram of Amphihevir degraded by oxidation (30% H2O2 solution)

圖6 安非合韋高溫(60 ℃，10 d)破壞色譜圖Fig 6 Chromatogram of Amphihevir degraded by high temperature (60 ℃，10 days)

圖7 安非合韋高濕(92.5RH%，10 d)破壞色譜圖Fig 7 Chromatogram of Amphihevir degraded by high humidity (92.5RH%，10days)

圖8 安非合韋強(qiáng)光(4 500 Lx±500 Lx，10 d)破壞色譜圖Fig 8 Chromatogram of Amphihevir degraded by highlight (4 500 Lx±500 Lx，10 days)

2.4 定量限和檢測(cè)限

配制多個(gè)較低濃度水平的安非合韋溶液，分別進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)信噪比為3左右即確定為檢測(cè)限，當(dāng)信噪比為10左右即確定為定量限。測(cè)得的結(jié)果顯示，安非合韋檢測(cè)限位0.008 99 μg·mL-1，定量限為0.029 98 μg·mL-1。

2.5 重復(fù)性及中間精密度

通過一份樣品，重復(fù)進(jìn)樣6針檢測(cè)確認(rèn)測(cè)定方法的重復(fù)性，并由另一個(gè)操作者重復(fù)進(jìn)樣3針，共9針確認(rèn)安非合韋有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的中間精密度。本品有關(guān)物質(zhì)方法的重復(fù)性RSD為0.01%，中間精密度RSD為0，重復(fù)性和中間精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性

配制一份供試品溶液，將該溶液在常溫下分別放置不同的時(shí)間，分別按照選定的色譜條件進(jìn)樣，記錄譜圖，以此來考察溶液的穩(wěn)定性。安非合韋主峰峰面積的RSD為0.61%，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 方法耐用性

通過改變不同HPLC條件如流速、柱溫、流動(dòng)相配比來評(píng)估測(cè)定條件有微小的變動(dòng)時(shí)，判斷結(jié)果受影響的程度，以此來判斷方法的耐用性。結(jié)果顯示，流速為0.9～1.1 mL·min-1，流動(dòng)相0.1%磷酸水溶液∶乙腈配比變化為4∶6或6∶4，理論塔板數(shù)均大于18 000，拖尾因子均小于1.078，分離度均大于3.0，均符合檢測(cè)要求，方法耐用性良好。

2.8 樣品的測(cè)定

按照HPLC有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，分別對(duì)常州寅盛藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的三批中試規(guī)模樣品進(jìn)行了測(cè)試，批號(hào)為批號(hào)為201403-03-141207, 201403-03-141208，201403-03-141209，3批樣品純度分別為99.53%，99.44%和99.43%，最大單個(gè)雜質(zhì)分別為0.15%，0.15%和0.21%。最大單雜和總雜均符合臨床申報(bào)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 討 論

3.1 安非合韋有關(guān)物質(zhì)的方法開發(fā)

波長(zhǎng)的選擇：對(duì)安非合韋合成工藝的起始原料、中間體及成品均進(jìn)行了DAD全波長(zhǎng)掃描，考察了各已知雜質(zhì)組分的吸收波長(zhǎng)，安非合韋的最大吸收在220 nm左右，主要起始原料和中間體的最大吸收在205 nm左右，但是考慮到205 nm波長(zhǎng)處基線不穩(wěn)，綜合考慮決定選擇210 nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

色譜柱的選擇：通過改變色譜柱型號(hào)，根據(jù)理論塔板數(shù)和拖尾因子來判定柱子的選擇。篩選了依利特、Waters、Thermo和Kromasil的C18柱，由測(cè)試數(shù)據(jù)可知，選用Thermo C18、KromasilC18色譜柱時(shí)，各峰理論塔板數(shù)均高于其他色譜柱，分離度也較好，因此可選用Thermo C18、KromasilC18色譜柱作為檢測(cè)所用色譜柱。

3.2 后續(xù)方法開發(fā)

安非合韋屬于1.1類創(chuàng)新藥物，目前處于臨床階段，尚未對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行全面研究。在后續(xù)開發(fā)中，我們將按照ICH指南、CDE相關(guān)藥學(xué)研究指南和中國(guó)藥典的要求，爭(zhēng)取最大程度減少工藝中超過0.1%限度的雜質(zhì)，若超過，則對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行鑒定研究以及必要的毒理學(xué)研究。本文的研究可為后續(xù)方法開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，并為創(chuàng)新藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一些參考。

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