宮曉平,崔璐璐,董 琨,楊桂英

(張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心,張家口 075000)

腺苷鈷胺即腺苷輔酶維生素B12,化學(xué)名為5,6-二甲基苯并咪唑基-5-脫氧腺嘌呤核苷基鈷胺,是維生素B12的活性輔酶形式之一,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[1-9],腺苷鈷胺對(duì)B12缺乏引起的貧血、多發(fā)性神經(jīng)炎、三叉神經(jīng)痛、肝病、長(zhǎng)期萎縮性胃炎和急性視神經(jīng)炎等疾病均具有較好的療效；也可與其他藥物聯(lián)合使用[10-12],治療帶狀皰疹、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病及糖尿病周圍神經(jīng)病變等疾病。腺苷鈷胺的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,對(duì)光敏感[13-14],對(duì)酸、堿、熱[15]和氧亦不穩(wěn)定,易分解產(chǎn)生腺苷、羥鈷胺素[16-17]等雜質(zhì)。腺苷鈷胺片劑所用輔料、生產(chǎn)工藝[18-19]及其去除包衣的方法[20]等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生一定的影響?！吨袊?guó)藥典》2015年版二部[21]規(guī)定腺苷鈷胺的實(shí)驗(yàn)條件均在避光條件下進(jìn)行。本文通過(guò)在可見(jiàn)光區(qū)波長(zhǎng)范圍內(nèi)選取7個(gè)波段、5個(gè)光照強(qiáng)度,參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[22-23],確定光照射時(shí)間為40 min,通過(guò)所測(cè)含量考察對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性[24],對(duì)腺苷鈷胺的降解率進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010A型高效液相色譜儀(包括二元泵、在線脫氣機(jī)、PDA二極管陣列檢測(cè)器等)，LC-30A型超高效液相色譜儀串聯(lián)8060型串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)；YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm；批號(hào)0425067794；十八烷基硅烷鍵合硅膠,YMC股份有限公司)；Shim-pack GISS C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm；批號(hào)227-30048-01；十八烷基硅烷鍵合硅膠，島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司)；CPA225D型精密電子天平(賽多利斯集團(tuán))；超純水機(jī)(Millipore公司)；DTC-15型超聲波清洗儀(鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司,40 kHz)；TES-1334A型數(shù)位式照度計(jì)(泰仕電子工業(yè)股份有限公司)；LED光燈(寧波良亮燈飾總廠,6 W,DC 5 V)；濾光片(飛宇達(dá)光電科技有限公司,8 cm×8 cm)。

1.2試藥 腺苷鈷胺對(duì)照品(批號(hào)140658-201302,質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.3%),腺苷對(duì)照品(批號(hào)110879-200202),肌苷對(duì)照品(批號(hào)140669-201104),氰鈷胺對(duì)照品(維生素B12，批號(hào)100248-200802,質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.7%)，均為中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；甲鈷胺對(duì)照品(批號(hào)L270P20,質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.0%,北京百靈威科技有限公司)；羥鈷胺素乙酸鹽(批號(hào)5KBZO-BK,質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97.0%,東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；乙腈(Fisher Scientific試劑公司,色譜純)；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純)；甲酸(Fisher Scientific試劑公司,液質(zhì)聯(lián)用級(jí))；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)；水由Milli-Q純化系統(tǒng)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及溶液制備

2.1.1色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm；批號(hào)0425067794)。以乙腈為流動(dòng)相A,以0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2)∶乙腈(90∶10)為流動(dòng)相B,進(jìn)行線性梯度洗脫(0～7 min,2%A→9%A；7～14 min,9%A；14～30 min,9%A→2%A)。流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2波長(zhǎng)的選取 在400～700 nm范圍內(nèi),每隔50 nm選取1個(gè)波長(zhǎng),采用400±10,450±10,500±10,550±10,600±10,650±10和700±10 nm的濾光片,對(duì)可見(jiàn)光光波進(jìn)行過(guò)濾的方式實(shí)現(xiàn)。

2.1.3光照強(qiáng)度的選取 選取50,100,200,300,400和500 lx的光照強(qiáng)度對(duì)腺苷鈷胺對(duì)照品溶液進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn),光照強(qiáng)度用照度計(jì)進(jìn)行測(cè)定并確認(rèn)。

2.1.4對(duì)照品溶液的制備 精密稱取腺苷鈷胺對(duì)照品適量,加水制成1 mL含100.030 08 μg的溶液,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液。避光操作。

2.1.5供試品溶液的制備 取腺苷鈷胺對(duì)照品溶液,分別在所選定的波長(zhǎng)與光照強(qiáng)度條件下照射40 min,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液。

2.2測(cè)定結(jié)果 取腺苷鈷胺對(duì)照品溶液與照射后的供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。在400 nm的波長(zhǎng)處、200 lx的光照強(qiáng)度下照射40 min,色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1樣品在400nm波長(zhǎng)處、200lx下照射40min的色譜圖

1.雜質(zhì)峰1；2.腺苷；3.腺苷；4.羥鈷胺素；5.腺苷鈷胺。

Fig.1 Chromatograms of the sample radiated for 40 min under the wavelength of 400 nm and the illumination intensity of 200 lx

1.impurity peak 1；2.adenosine；3.adenosine；4.hydroxocobalamin；5.cobamamide.

由圖1可知,腺苷鈷胺光降解后出現(xiàn)4個(gè)雜質(zhì)峰,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,雜質(zhì)峰1可能為腺苷分子中核糖結(jié)合了一個(gè)氧原子[16]。經(jīng)對(duì)照品定位及二極管陣列檢測(cè)器確認(rèn),雜質(zhì)峰2和3與腺苷對(duì)照品的保留時(shí)間及其紫外光譜圖一致,雜質(zhì)峰4與羥鈷胺素對(duì)照品的保留時(shí)間及其紫外光譜圖一致,初步推斷腺苷鈷胺的主要光降解產(chǎn)物雜質(zhì)Ⅱ(雜質(zhì)峰2和3)為腺苷、雜質(zhì)Ⅲ(雜質(zhì)峰4)為羥鈷胺素,并采用質(zhì)譜作進(jìn)一步確認(rèn)。

根據(jù)腺苷鈷胺光降解后的峰面積確定腺苷鈷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍。精密量取2.1.4項(xiàng)下的腺苷鈷胺對(duì)照品溶液1.5,5,5,7.5,12.5和20 mL,分別置于100,100,50,25,25和25 mL量瓶中,加水定容,搖勻,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),即得腺苷鈷胺對(duì)照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL,按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析,以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度 (μg·mL-1)為橫坐標(biāo)x、色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=26 631x-4 941.4,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

由回歸方程計(jì)算出照射后的各供試品溶液中腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度值(μg·mL-1),以光照強(qiáng)度為橫坐標(biāo)x、供試品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標(biāo)y繪制不同波長(zhǎng)下腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢(shì)圖,見(jiàn)圖2。

由圖2可知,腺苷鈷胺在600 nm的波長(zhǎng)處降解率最低，在50 lx的光照強(qiáng)度下降解最少,100 lx的光照強(qiáng)度下降解后的百分含量為96.52%,200 lx的光照強(qiáng)度下降解后的百分含量為93.16%。即在波長(zhǎng)600 nm、光照強(qiáng)度50～100 lx的條件下腺苷鈷胺降解率最低。

圖2不同波長(zhǎng)下腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢(shì)圖

Fig.2 Mass concentration trend chart after cobamamide degradation at the different wavelengthes

以本文選取的光照條件(600 nm的波長(zhǎng),50 lx的光照強(qiáng)度)與用傳統(tǒng)避光燈在50 lx的光照強(qiáng)度下的避光效果進(jìn)行比較。選取10,15,20,30和40 min的光照時(shí)間,按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析,由回歸方程計(jì)算出照射后的各供試品溶液中腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度值(μg·mL-1),以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)x、光照后的供試品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標(biāo)y,繪制腺苷鈷胺降解后的質(zhì)量濃度趨勢(shì)圖,見(jiàn)圖3。

由圖3可知,用避光燈在50 lx下操作,腺苷鈷胺降解率均高于在600 nm波長(zhǎng)處50 lx光照的降解率。由此可見(jiàn),以本文選定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行避光的效果比用傳統(tǒng)避光燈的避光效果更優(yōu)。

圖3選定條件與避光燈條件下腺苷鈷胺降解后質(zhì)量濃度趨勢(shì)圖

Fig.3 Concentration trend chart after cobamamide degradation under the selected condition and avoiding light condition

3 質(zhì)譜確認(rèn)

3.1色譜條件 Shim-pack GISS C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm；批號(hào)227-30048-01)。以0.2 mL·L-1的甲酸水溶液為流動(dòng)相A,以0.2 mL·L-1的甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B,進(jìn)行線性梯度洗脫(0～0.5 min,95% A；0.5～3 min,95% A→5% A；3～4 min,5% A；4～4.1 min,5% A→95% A；4.1～6 min,95% A)。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

3.2質(zhì)譜條件 正離子檢測(cè)模式；離子源：ESI源；離子源溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣流量：3 L·min-1；加熱氣流量：15 L·min-1；干燥氣流量：5 L·min-1。

3.3對(duì)照品溶液的制備 精密稱取腺苷鈷胺對(duì)照品、腺苷對(duì)照品和羥鈷胺素乙酸鹽適量,分別加水制成1 mL含腺苷鈷胺10 ng、腺苷10 ng和羥鈷胺素1 ng的溶液。避光操作。

3.4供試品溶液的制備 取腺苷鈷胺對(duì)照品溶液在400 nm波長(zhǎng)處,以200 lx的光照強(qiáng)度照射40 min,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液。

經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn),雜質(zhì)Ⅱ?yàn)橄佘?雜質(zhì)Ⅲ為羥鈷胺素。腺苷鈷胺、腺苷和羥鈷胺素的LC-MS/MS測(cè)定圖見(jiàn)圖4。

圖4腺苷鈷胺、腺苷和羥鈷胺素的LC-MS/MS色譜圖

1.混合對(duì)照色譜圖；B.樣品色譜圖；1.腺苷；2.羥鈷胺素；3.腺苷鈷胺。

Fig.4 LC-MS/MS chromatogram of cobamamide,adenosine and hydroxocobalamin

1.mixed chromatogram；B.sample chromatogram；1.adenosine；2.hydroxocobalamin；3.cobamamide.

4 討論

4.1腺苷鈷胺的光降解產(chǎn)物確認(rèn) 腺苷鈷胺、氰鈷氨、甲鈷胺及羥鈷胺均為維生素B12類物質(zhì)。經(jīng)本文驗(yàn)證,腺苷鈷胺光降解產(chǎn)物并無(wú)氰鈷胺及甲鈷胺。經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)后,腺苷鈷胺的主要光降解產(chǎn)物為腺苷及羥鈷胺。

4.2腺苷鈷胺避光操作的必要性 腺苷鈷胺水溶液對(duì)光極為敏感,在日光下(光照強(qiáng)度為1 000 lx)照射10 min,含量剩余20.23%,照射20 min含量剩余4.08%,照射30 min含量?jī)H剩0.73%。因此,腺苷鈷胺的相關(guān)實(shí)驗(yàn)必須嚴(yán)格執(zhí)行避光操作。

4.3照射時(shí)間的選取 《中國(guó)藥典》2015年版二部中腺苷鈷胺片含量測(cè)定項(xiàng)下[21]規(guī)定：超聲20 min,離心15 min；文獻(xiàn)[22]中腺苷鈷胺片溶出度測(cè)定時(shí)間為30 min。綜上所述,本文選取40 min為光照時(shí)間,可有效滿足制劑分析的前處理要求。

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