張明淋，謝曉燕，王雪敏，卞君醒，張自強 ，何淑旺

(1.江蘇省省級機關醫(yī)院，南京 210024；2.南京澤恒醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司，南京 210042；3.南京師范大學生命科學院，南京 210042；4.山東達因海洋生物制藥股份有限公司，北京 100102)

皮炎濕疹合并感染，尤其是條件致病性真菌感染發(fā)病率很高，使得抗真菌藥與皮質激素聯(lián)合應用有極大的優(yōu)勢[1]。復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏既具有抗真菌作用，也能使炎癥癥狀快速消退，方便患者使用[2-4]。本研究建立了同時檢測氫化可的松和硝酸咪康唑累計釋藥量的HPLC法，并通過Franz擴散池檢測復方藥物體外透皮情況，通過與參比制劑F2的計算，最終確定處方制劑[5-9]。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPD-M20A高效液相色譜系統(tǒng)(包括LC-20A泵、SPD-M20A檢測器，日本島津公司)；Agilent C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5m)；TK-12A透皮吸收儀(上海偕凱科技貿易有限公司)。

1.2試藥 氫化可的松對照品(批號100152-200206),硝酸咪康唑對照品(批號100213-200706)，均購自中國食品藥品檢定研究院；復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏(自制，批號：160218-1，160218-3，160218-4，160218-5)；參比制劑(Daktacort?ointment，Janssen-Cilag Ltd， BGB0Z0006-2014)；乙腈為色譜純；水為純化水；其他化學試劑均為分析純。

1.3動物 雄性小鼠，體質量20±2 g,由中國藥科大學提供，合格證號：SYXK(蘇)：2012-0035。

2 方法與結果

2.1HPLC法驗證

2.1.1色譜條件 參照英國藥典BP-2013[10]“Miconazole and Hydrocortisone Ointment”，建立復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏透皮釋放度含量測定方法：色譜柱為Agilent C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5m)；以0.01 mol·L-1的磷酸二氫銨溶液(用稀氨水調節(jié)pH值為6.0)為流動相A，乙腈為流動相B；以1.5 mL·min-1流速進行梯度洗脫；檢測波長為235 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為20L。洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 Gradient elution program

時間/min流動相A/%流動相B/%08020202080252080278020328020

2.1.2溶液的制備 對照品溶液：取硝酸咪康唑對照品25 mg，氫化可的松對照品12.5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇40 mL超聲溶解，加水稀釋定容至刻度，精密移取4 mL，置于100 mL量瓶中，加體積分數(shù)為20%的無水乙醇生理鹽水定容至刻度，作為對照品溶液。

供試品溶液：取本品適量(含硝酸咪康唑25 mg，氫化可的松12.5 mg)，精密稱定，按照上述對照品溶液的配制方法進行配制，作為供試品溶液。

陰性供試品溶液：取空白輔料適量，按照上述對照品溶液的配置方法進行配制，作為陰性供試品溶液。

2.1.3專屬性 取2.1.2項下制備的對照品溶液、陰性供試品溶液及空白透皮介質，按照2.1.1項下的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。結果表明，空白溶劑和空白輔料均無干擾，此方法專屬性良好，見圖1。

圖1方法學專屬性實驗疊圖

A.空白透皮介質；b.陰性供試品溶液；c.供試品溶液；1.氫化可的松；2.硝酸咪康唑。

Fig.1 The overlay of specific test in methodology

A.transdermal medium；b.negative sample solution；c.sample solution；1.hydrocortisone；2.miconazole nitrate.

2.1.4標準曲線 精密稱取硝酸咪康唑25.12 mg，氫化可的松12.51 mg，按照2.1.2項下方法配制對照品儲備液，分別取40 μL及0.4，2，4和5 mL，分別置于100 mL量瓶中，用體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水稀釋至刻度，搖勻，各取20 μL進樣，記錄色譜圖，以峰面積y對質量濃度x(mg·L-1)進行線性回歸，繪制標準曲線，氫化可的松的線性方程為y=27 723x+1 712.3(r=0.999 5，n=5)，表明氫化可的松質量濃度在0.10～12.51 mg·L-1范圍內線性關系良好；硝酸咪康唑的線性方程為y=19 441x+798.52(r=0.999 6，n=5)，表明硝酸咪康唑質量濃度在0.20～25.12 mg·L-1范圍內線性關系良好。

2.1.5穩(wěn)定性 精密移取對照品儲備液適量，定量稀釋制成含氫化可的松和硝酸咪康唑質量濃度分別為10和20 mg·L-1(完全釋藥率的10%)的溶液，室溫放置，分別于0，6，12，24，48和72 h精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明，72 h內氫化可的松與硝酸咪康唑的峰面積RSD值均小于2.0%，結果表明，供試品溶液室溫放置72 h內穩(wěn)定。

2.1.6重復性 取同一批號的復方咪康唑氫化可的松軟膏，按照2.1.2項下方法分別平行配制6份供試品溶液進行測定。結果顯示，復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏中的硝酸咪康唑峰面積RSD值為1.25%，氫化可的松峰面積RSD值為1.27%，結果表明，該方法重復性良好。

2.1.7精密度 分別稱取按處方比例制備的空白輔料混合物各12份，精密稱定，3份1組，釋藥率在0.1%～10%范圍內，分別向每組加入低、中、高質量濃度的對照品溶液，按照2.1.2項下方法配制供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表2，該方法精密度較好。

表2硝酸咪康唑和氫化可的松的加樣回收率結果

Tab.2 The results of addition recoveries for hydrocortisone and miconazole nitrate

加入量/%硝酸咪康唑回收率/%RSD/%氫化可的松回收率/%RSD/%0.199.4100.199.9100.4100.9100.199.6100.60.5100.0100.7100.4100.71.099.6101.2100.1100.499.8100.510.099.8100.2100.3100.2100.2100.4

2.2溶解度考察 分別考察原料硝酸咪康唑和氫化可的松在質量濃度為9 g·L-1氯化鈉、pH值為6.8的緩沖鹽和體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水中的溶解情況，結果顯示，氫化可的松在質量濃度為9 g·L-1氯化鈉與pH值為6.8的緩沖鹽中極微溶，在體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水中微溶，硝酸咪康唑在質量濃度為9 g·L-1氯化鈉與體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水中極微溶，在pH值為6.8緩沖鹽中幾乎不溶，用HPLC法檢測，結果顯示，氫化可的松和硝酸咪康唑在17 mL(為立式擴散池，體積為17 mL)含體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水中能滿足漏槽條件，故初步選擇其為透皮介質。

2.3漏槽實驗 取復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏0.2 g，置于立式擴散池中，分別以質量濃度為9 g·L-1氯化鈉、pH值為6.8緩沖鹽和含體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水6 mL為透皮釋放介質(n=6)，轉速為300 r·min-1，溫度為37±0.5 ℃，30 h后，取樣過濾，按照2.1.1項下色譜條件進行檢測。結果表明，復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏中的氫化可的松和硝酸咪康唑在體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水6 mL中能完全溶解，滿足漏槽實驗條件，在質量濃度為9 g·L-1的氯化鈉、pH值為6.8的緩沖鹽中不能完全溶解。因此，選擇體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水作為透皮介質。

2.4透皮吸收實驗 采用立式擴散池[11-16]，以體積分數(shù)為20%的乙醇生理鹽水為透皮介質，以離體小鼠皮為載體，轉速為300 r·min-1，依法操作，經(jīng)32 h，取適量溶液濾過，作為透皮吸收供試品溶液。

2.5計算方法 氫化可的松透皮釋放度(%)=(A氫樣×M氫×r氫×V樣)÷(V對×A氫對×m×1%)×100%

硝酸咪康唑透皮釋放度(%)=(A硝樣×M硝×r硝×V樣)÷(V對×A硝對×m×2%)×100%

注：A氫樣：供試品溶液中氫化可的松的峰面積；A硝樣：供試品溶液中硝酸咪康唑的峰面積；A氫對：對照品溶液中氫化可的松的峰面積；A硝對：對照品溶液中硝酸咪康唑的峰面積；M氫：氫化可的松對照品稱樣量；r氫：氫化可的松對照品含量；M硝：硝酸咪康唑對照品稱樣量；r硝：硝酸咪康唑對照品含量；V樣：釋放介質體積；V對：對照品溶液稀釋體積；m：樣品稱樣量。

2.6參比透皮通過率實驗 取參比制劑Daktacort?cream適量，分別采用半透膜、小鼠皮(雄性小鼠，體質量為22±2 g，由江蘇省實驗動物中心提供)進行透皮通過率測定，取樣時間為2，4，6，24和36 h，結果見圖2。

圖2參比Daktacort?onimentde中氫化可的松和硝酸咪康唑的透皮通過率曲線

A.氫化可的松；B.硝酸咪康唑。

Fig.2 Transdermal curve of hydrocortisone and miconazole nitrate in Daktacort?onimentde

A.hydrocortisone；B.miconazole nitrate.

參比制劑采用半透膜和小鼠皮進行透皮通過率實驗時，36 h內取樣硝酸咪康唑和氫化可的松透皮通過率均小于2%，其中離體小鼠皮藥物通過率高于半透膜，故選用其為透皮實驗膜。

2.7處方研究 分別測定批號160218-1，160218-3，160218-4和160218-5的處方(處方160218-3，160218-4和160218-5分別為輕質液體石蠟的量從25%升至50%，白凡士林的量從70%降至35%，硬脂酸的量從5%升至15%)，采用離體小鼠皮膚通過Franz擴散池進行藥物滲透量測定，取樣時間為2，4，6，24和36 h，計算各時間點累積通過率，并繪制曲線，與參比測定結果進行比較，篩選出與參比透皮通過率基本一致的處方[17-19]。實驗結果見圖3。

由實驗結果可知，批號為160218-3的處方各時間點累積通過率與參比制劑基本一致，再結合處方開發(fā)的其他考察指標和參比制劑釋放度進行F2一致性比較，因此選擇批號為160218-3的處方為最佳處方。

圖3處方篩選中氫化可的松和硝酸咪康唑透皮累積通過率曲線

A.氫化可的松；B.硝酸咪康唑。

Fig.2 Transdermal curve of hydrocortisone and miconazole nitrate by formula optimization

A.hydrocortisone；B.miconazole nitrate.

3 討論

復方硝酸咪康唑氫化可的松軟膏作為僅在給藥局部發(fā)揮作用的劑型，主要考察外用藥物透過皮膚進入體內循環(huán)的滲透量，同時關注藥物的局部安全性問題。本次實驗考察了不同處方及參比制劑累積滲透量，由結果可知，該藥物僅發(fā)揮局部作用，32 h皮膚通過率均小于2%，表明本供試品無全身吸收作用。

本文引入了口服固體釋放F2因子比較法，比較不同處方和原研制劑的累積通過率，通過F2因子的比較很容易確定最佳釋放的處方。

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