王 芳,王四旺,姚敏娜,苗乃周,劉玉林*

(1.西安思源學(xué)院,西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué),西安 710032)

目前,癌癥死亡占全球死亡人數(shù)的13%,預(yù)計到2030年,全球癌癥患者死亡人數(shù)每年將達(dá)到120萬人。女性患者中,乳腺癌占癌癥總數(shù)的23%[1]。乳消康膠囊是蘭州軍區(qū)醫(yī)療單位非標(biāo)準(zhǔn)制劑,制劑文號為蘭制字(2011)F68051,由青皮、香附和枳殼等11味中藥組成,具有活血化淤、疏肝行氣、消積化滯和調(diào)經(jīng)止痛的作用,主治各種乳腺增生癥、乳腺腫痛及乳腺腺瘤等癥。制劑制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已制定數(shù)十年,現(xiàn)已不能滿足現(xiàn)代制劑的要求。本實驗采用L9(34)正交實驗,以君藥青皮和臣藥枳殼中的主要成分柚皮苷和橙皮苷的含量及出膏率為評價指標(biāo),對乳消康膠囊的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)選,確定最佳工藝條件,保證制備工藝穩(wěn)定可行。以前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對其中3味藥進(jìn)行了TLC鑒別,沒有含量測定。楊天鳴等[2]研究,加入橙皮苷的含量測定,但本品藥味較多,1種成分不能有效控制本品質(zhì)量,故本實驗增加香附和枳殼的顯微鑒別,對君藥青皮、香附,臣藥中的丹參、當(dāng)歸、川芎、枳殼以及使藥甘草進(jìn)行了TLC鑒別,并采用HPLC法同時測定青皮和枳殼中主要成分柚皮苷和橙皮苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 渝澳浦UB100i系列生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)；OLYMPUS DP70顯微鏡數(shù)碼相機(奧林巴斯(中國)有限公司)；DZF型真空干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司)；DZKW-D-1電熱恒溫水浴鍋(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；LC-15C液相色譜儀(日本島津公司)；PS-08超聲波清洗器(深圳市恒達(dá)康科技有限公司)；MS104S型分析電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；ZF-1型暗箱式四用紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)。

1.2試藥 乳消康膠囊 (0.38 g·粒-1,批號：150301,150502,150703)(第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科)；當(dāng)歸(批號120918-200613),川芎對照藥材(批號120918-200608),新橙皮苷(批號111857-201102),丹參酮ⅡA對照品(批號110766-200619),甘草對照藥材(批號120904-200511),柚皮苷對照品(批號110722-201312)和橙皮苷對照品(批號0721-100010),均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈,色譜純(德國默克公司)；水,注射用水(制水機：Milli-Q Advantage)(德國默克密斯里公司)；其余化學(xué)試劑均為分析純(天津化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1制備工藝研究

2.1.1制備工藝 將枳殼、香附和羌活3味藥材在60 ℃以下溫度烘干,粉碎,過100目篩,細(xì)粉備用；粗粉與余下石菖蒲、麥芽等8味藥材用水煎煮2次,每次加6倍量水,煎煮2 h,過濾,合并2次濾液并減壓濃縮成稠膏(熱測,相對密度為1.10～1.15)；將細(xì)粉和清膏混勻,60 ℃以下溫度烘干,粉碎,混勻,分裝即得。

2.1.2最佳工藝考察 通過預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),影響提取率的主要因素是煎煮次數(shù)、煎煮時間和煎煮時每次加水量。故本實驗選擇煎煮次數(shù)(A)、煎煮時間(B)和煎煮時每次加水量(C)為考察因素,按照L9(34)正交實驗表進(jìn)行實驗,見表1。君藥青皮和臣藥枳殼中的主要成分為柚皮苷和橙皮苷,在考察最優(yōu)工藝時,選擇柚皮苷和橙皮苷作為水提工藝篩選的主要指標(biāo),故綜合評價時權(quán)重系數(shù)分別定為0.4；另一方面干膏得率是確定提取率及包裝規(guī)格的重要參數(shù),其與療效強度不成量效關(guān)系,故綜合評價時權(quán)重系數(shù)以0.2為宜。

以干浸膏得率、柚皮苷及橙皮苷含量為評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評價,篩選出最佳提取工藝條件。

表1L9(34)正交實驗因素與水平

Tab.1 L9(34) orthogonal test factors and levels

水平A,煎煮次數(shù)/次B,煎煮時間/hC,加水量/倍1116221.5833210

2.1.3HPLC法測定浸膏中柚皮苷和橙皮苷的含量 按照2.4項下方法測定干浸膏中柚皮苷和橙皮苷的含量。

2.1.4實驗結(jié)果 將處方提取液濃縮干燥,用真空干燥箱干燥至恒質(zhì)量后計算干膏得率,干膏得率(%)=干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量。見表2。由表2可知,在3個因素中,A>B>C。方差分析結(jié)果見表3。由表3可知,A因素差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜合比較實驗最終結(jié)果為A3B3C1,即確定最佳提取工藝為：水煎煮3次,每次2 h,每次加6倍量水。

表2L9(34)正交實驗安排及直觀分析結(jié)果

Tab.2 The results of L9(34) orthogonal experiment arrangement and intuitive analysis

實驗號ABCD收膏率/%橙皮苷含量/μg·g-1柚皮苷含量/μg·g-1綜合評分1111116.7813.512.0255.632122217.2815.782.6866.273133317.0514.693.0165.314212316.1913.673.2165.175223120.0118.973.8983.766231221.3419.984.8994.947313217.6516.993.7977.308321321.5120.084.2289.789332123.8921.564.5697.30K162.40366.03380.117K281.29079.93776.247K388.12785.85075.457R25.72419.8174.660

表3方差分析結(jié)果

Tab.3 The results of variance analysis

方差來源偏差平方和自由度F方差顯著性A1065.14228.54532.57P<0.05B620.97216.64310.49C37.3221.0018.66F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.2顯微鑒別 取本品粉末少許,研細(xì),過65目篩,將細(xì)粉置于顯微鏡下觀察。分泌細(xì)胞類圓形,直徑35～72 μm,含淡黃棕色至紅棕色分泌物,香附的周圍細(xì)胞呈放射狀排列；枳殼的草酸鈣方晶成片存在于薄壁組織中。

2.3定性鑒別

2.3.1香附 取乳消康膠囊內(nèi)容物2 g,加乙醚50 mL,密塞,振搖,靜置1 h,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解,作為供試品溶液。另取香附對照藥材和缺香附的陰性樣品各2 g,同法制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版一部通則0502)實驗,吸取上述3種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑,展開,取出,晾干。噴灑質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的香草醛硫酸溶液,105 ℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性無干擾。見圖1A。

2.3.2川芎和當(dāng)歸 取乳消康膠囊內(nèi)容物2 g,加乙醚50 mL,置于水浴上加熱回流1 h,放冷,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解,作為供試品溶液。另取川芎和當(dāng)歸對照藥材各1 g以及缺川芎和當(dāng)歸的陰性樣品2 g,同法制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版一部通則0502)實驗,吸取上述3種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。置于紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性對照無干擾。見圖1B和1C。

2.3.3青皮和枳殼 取乳消康膠囊內(nèi)容物2 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2 mL作為供試品溶液。另取新橙皮苷對照品,加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對照品溶液。取缺青皮和枳實的陰性樣品2 g,同法制成陰性對照溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版一部通則0502)實驗,吸取上述3種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑,展開,取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液(4 ℃放置12 h以上)為展開劑,展開至8 cm左右位置取出,晾干。噴以三氯化鋁乙醇試液,置于紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性對照無干擾。見圖1D。

2.3.4丹參 取乳消康膠囊內(nèi)容物2 g,加乙醇50 mL,冷浸1 h,過濾,將濾液濃縮至2 mL,作為供試品溶液。另取丹參酮ⅡA對照品,加乙醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。取缺丹參的陰性樣品2 g,同法制成陰性對照溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版一部通則0502)實驗,吸取上述3種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。在日光下觀察,供試品色譜中,在與對照品相應(yīng)位置上顯相同橘色斑點,且陰性無干擾。見圖1E。

2.3.5甘草 取乳消康膠囊內(nèi)容物2 g,加乙醚50 mL,加熱回流1 h,棄乙醚液,藥渣揮干。藥渣再加甲醇50 mL,加熱回流1 h,放冷,濾紙濾過,在水浴鍋上蒸干,加水20 mL使溶解。用水飽和正丁醇分別振揺提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液。用水分別振揺洗滌正丁醇液3次,每次20 mL,棄水液。把正丁醇液在水浴上蒸干,加甲醇2 mL溶解,作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.5 g和缺甘草的陰性樣品2 g,同法制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版一部通則0502)實驗,吸取上述3種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。在紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中,在與對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點,且陰性無干擾。見圖1F。

圖1TLC圖

A.香附；B.當(dāng)歸；C.川芎；D.青皮、枳殼；E.丹參；F.甘草；1.陰性溶液；2.對照藥材溶液；3～5.供試品溶液。

Fig.2 TLC chromatograms

A.Cyperusrotundus；B.Angelicasinensis；C.Ligusticumwallichii；D.Green Tangerine Peel andFructusaurantii；E.Salviamiltiorrhiza；F.Licorice；1.negative control solution；2.reference substance solution；3-5.sample solution.

2.4含量測定

2.4.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱為Global Chromatography GS-120-5 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Unimicrotech) (上海通微分析技術(shù)有限公司)；流動相：乙腈-3 mL·L-1磷酸水(19.5∶80.5)；檢測波長：383 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫:室溫；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按照柚皮苷計算應(yīng)不低于3 500。

2.4.2溶液的制備 混合對照品溶液：分別取柚皮苷和橙皮苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成柚皮苷和橙皮苷質(zhì)量濃度分別為8.14和28 μg·mL-1的混合溶液,即得。

供試品溶液：取干浸膏2 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入50 mL甲醇,稱定質(zhì)量,冷熱回流1.5 h,冷卻后,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液2 mL置于50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

陰性溶液：按照上述供試品溶液的制備方法,取按照生產(chǎn)工藝制備的缺青皮、枳殼藥材的陰性樣品適量,同法制備陰性對照溶液。

2.4.3干擾性實驗 精密吸取2.4.2項下制備的3種溶液各20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,陰性對照品溶液在柚皮苷、橙皮苷相應(yīng)保留時間處均未檢出色譜峰,結(jié)果表明,處方中其他成分不干擾柚皮苷和橙皮苷的測定。見圖2。

圖2HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C陰性對照；1.柚皮苷；2.橙皮苷。

Fig.9 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.naringin；2.hesperidin.

2.4.4線性關(guān)系考察 精密稱取柚皮苷對照品9.78 mg,加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為97.8 μg·mL-1的溶液,精密量取該溶液0.5,1,2,5和10 mL,用甲醇稀釋至10 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為4.89,9.78,19.56,48.9和97.8 μg·mL-1的溶液,作為對照品溶液。分別進(jìn)樣20 μL,測定峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、橙皮苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程為y=35 676.78x-17 507.120 58(r=0.999 8)。精密稱取橙皮苷對照品16.8 mg,加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為168 μg·mL-1的溶液,精密量取該溶液1,2,3,5和10 mL,用甲醇稀釋至10 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為16.8,33.6,50.4,84和 168 μg·mL-1的溶液,作為對照品溶液。分別進(jìn)樣20 μL,測定峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、橙皮苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程為y=35 541.75x-17 148.8(r=0.999 8)。實驗結(jié)果表明,柚皮苷和橙皮苷質(zhì)量濃度分別在4.89～97.8和16.8～168 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(批號150301),分別放置0,1,3,5,8和12 h進(jìn)樣,測得柚皮苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.65%和0.29%。結(jié)果表明,溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6精密度實驗 精密吸取2.4.2項下制備的對照品溶液,分別進(jìn)樣6次,每次20 μL,測得柚皮苷和橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.97%和0.19%。結(jié)果表明,儀器精密度良好,符合實驗要求。

2.4.7重復(fù)性實驗 取供試品(批號150502)5份,精密稱定,按照2.4.2項下方法制備供試品溶液,按照2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣,計算柚皮苷和橙皮苷的含量。結(jié)果顯示,柚皮苷和橙皮苷的平均含量分別為4.92和20.94 μg·g-1,RSD值分別為1.36%和1.96%。結(jié)果表明,該方法重復(fù)性良好。

2.4.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品(批號150502)9份,每份3 g,分別加入一定量的柚皮苷和橙皮苷對照品,按照2.4.2項下方法制備供試品溶液,按照2.4.1項下色譜條件進(jìn)樣,計算加樣回收率。結(jié)果柚皮苷和橙皮苷的平均回收率分別為99.56%和99.50%,RSD值分別為1.58%和0.79%。見表4。

2.4.9樣品含量的測定 取3批乳消康膠囊(0.38 g ·粒-1,批號：150301,150502,150703)。按照2.4.2項下方法制備供試品溶液,按照2.4.1項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果3批樣品中柚皮苷和橙皮苷的平均含量分別為1.86和7.95 μg·粒-1。

表4柚皮苷和橙皮苷的加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.4 Results of naringin and hesperidin recovery test (n=9)

3 討論

一般來說,采用多指標(biāo)綜合評分法進(jìn)行工藝優(yōu)選時,對不同指標(biāo)給出合適的權(quán)重是關(guān)鍵的問題[3-4],選擇不同的權(quán)重,很可能出現(xiàn)不同的評價結(jié)果。本文選取主要成分柚皮苷和橙皮苷作為水提工藝篩選的主要指標(biāo),綜合評價時權(quán)重系數(shù)分別定為0.4；另一方面干膏得率是確定提取效率及包裝規(guī)格的重要參數(shù),但其與療效強度不成量效關(guān)系,故綜合評價時權(quán)重系數(shù)定為0.2,使優(yōu)選出的工藝更加合理。

在優(yōu)化制備工藝的基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步提升了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用TLC法對本方中的君藥青皮、香附,臣藥中的丹參、當(dāng)歸、川芎、枳殼以及使藥甘草建立了檢測方法。君藥青皮、臣藥枳殼均為蕓香科植物的果實,均含有新橙皮苷、橙皮苷和柚皮苷[5-8]。本文用3種成分共同控制青皮和枳殼的質(zhì)量。在TLC鑒別中,利用文獻(xiàn)方法[9-10]測定了青皮和枳殼中的橙皮苷,在HPLC法中,建立同時測定了它們中的橙皮苷及柚皮苷的方法,筆者通過實驗比較了藥典方法[11]及文獻(xiàn)方法[9-10,12-13],最終確定出能同時測定2種成分的方法,該方法穩(wěn)定性好(RSD值分別為1.36%和1.96%),柚皮苷和橙皮苷的平均回收率分別為99.56%和99.50%,RSD值分別為1.58%和0.79%。經(jīng)過3批樣品實驗,本方法準(zhǔn)確、可靠,故納入標(biāo)準(zhǔn)。對于君藥香附,本文首先參考藥典方法對其進(jìn)行測定[11],但實驗結(jié)果不穩(wěn)定,顯色效果不好,故用文獻(xiàn)方法[14]對其進(jìn)行測定,經(jīng)過3批樣品的實驗驗證,該方法可靠、穩(wěn)定,故納入標(biāo)準(zhǔn)。在對丹參TLC鑒別中,藥典方法[11]在展開劑中有苯,對人體有傷害,本文參照文獻(xiàn)方法[15-16],實驗結(jié)果顯示該方法斑點清晰,更加安全、穩(wěn)定。

通過本文的研究,為乳消康膠囊提供了科學(xué)可靠的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),使其療效和質(zhì)量得到保障。

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