呂佳良， 劉 芳， 孫芝蘭， 王道營(yíng)， 許曉曦， 徐為民

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

精氨酸的生物合成和代謝因其代謝途徑的復(fù)雜性和多樣性吸引了大量的研究者。精氨酸及其前體(如多胺和一些抗生素)可參與一些代謝產(chǎn)物的生物合成。精氨酸降解的多種途徑在微生物中已有描述，某些情況下其中的幾個(gè)途徑在同種微生物中同時(shí)存在[1-2]。在這些降解途徑中，精氨酸脫亞胺酶(ADI)途徑是精氨酸降解最廣泛的厭氧途徑。精氨酸脫亞胺酶途徑包含3個(gè)反應(yīng)，參與的酶有精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)和氨基甲酸酯激酶(CK)(圖1)，并且完成了精氨酸到鳥氨酸、氨氣和CO2的轉(zhuǎn)化，其中生成1 mol ATP消耗1 mol精氨酸，因此ADI途徑是一些微生物主要的能量來源[2-3]。

有研究提出，精氨酸脫亞氨酶途徑對(duì)細(xì)菌在酸性環(huán)境中的存活起著重要作用[4-5]。Vrancken等進(jìn)行了在發(fā)酵乳桿菌IMDO130101中環(huán)境pH值下通過精氨酸脫亞氨酶途徑?jīng)Q定瓜氨酸和鳥氨酸釋放的試驗(yàn)[6]。然而到目前為止，還沒有關(guān)于精氨酸在細(xì)菌鹽脅迫條件下代謝規(guī)律的研究。本研究主要對(duì)糞腸球菌在不同鹽濃度條件下代謝精氨酸的規(guī)律進(jìn)行研究，可為解析該菌適應(yīng)酸脅迫環(huán)境的機(jī)制提供一定的參考，同時(shí)可為研究該菌在酸性條件下的生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糞腸球菌R-612-Z1(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所自鹽水鴨中分離獲得的產(chǎn)酪胺菌株)；乙腈、正己烷，均為色譜純；異硫氰酸苯酯(純度≥98%，美國(guó)Sigma公司)；三乙胺(純度≥99.5%，瑞士Fluka公司)；乙酸鈉(AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；M17培養(yǎng)基(山東青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度>99%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 活化菌種：取-40 ℃保藏的糞腸球菌R-612-Z1 600 μL接種到50 mL的M17培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h。

配制氯化鈉濃度分別為0%、2%、4%、6%的M17培養(yǎng)基，并加入1%的精氨酸，將活化好的菌液按4%接種，每隔 2 h 取2 mL菌液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)600 nm處菌液的吸光度。通過吸光度的變化規(guī)律，觀察糞腸球菌在不同濃度氯化鈉脅迫下的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 不同濃度氯化鈉培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中殘留精氨酸濃度的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)213.2 mg置于50 mL容量瓶中，用去離子水溶解并定容，搖勻即得L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋成濃度分別為4.264、2.132、1.066、0.533、0.267、0.133 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 樣品處理 在無菌操作臺(tái)上，用移液槍取8 mL菌液置于10 mL離心管中，用離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 樣品的提取和衍生化 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或菌液200 μL，加入0.1 mol/L的異硫氰酸苯酯-乙腈溶液 100 μL，1.0 mol/L的三乙胺-乙腈溶液100 μL，旋渦混勻后室溫放置1 h，加入400 μL正己烷溶液，旋渦混勻1 min并靜置10 min，取澄清的下層溶液200 μL用乙腈定容至1 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾后上液相色譜儀進(jìn)行分析。

1.2.2.4 色譜條件 Waters Alliance 2695液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，UV-2487紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為 0.1 mol/L 醋酸鈉-乙腈溶液(體積比93 ∶7)，流動(dòng)相B為水-乙腈溶液(體積比20 ∶80)，梯度洗脫條件見表1[7]。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 不同濃度氯化鈉培養(yǎng)條件下菌體內(nèi)精氨酸脫亞胺酶的表達(dá)量差異 將活化好的菌液按4%接種到不同氯化鈉濃度且添加1%精氨酸的M17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后，從每個(gè)樣品(每個(gè)處理3個(gè)重復(fù))取出3 mL菌液，4 ℃條件下以 10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min，收集沉淀物。使用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取菌泥的RNA。通過2%的瓊脂糖電泳和D260 nm/D280 nm的值對(duì)RNA的完整性、濃度和純度進(jìn)行鑒定。

使用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的PrimeScript RT reagent kit去除提取液中的DNA，并將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照寶生物工程(大連)有限公司的SYBR Premix ExTaqTM試劑盒的使用說明書配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系按照說明書添加。熒光定量PCR引物見表2。使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的ABI 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，不同樣品反應(yīng)體系設(shè)3次重復(fù)。分析各基因的CT值，利用Excel 2003軟件計(jì)算出標(biāo)化后的-ΔΔCT值，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算公式為ΔΔCT=未知樣品ΔCT-參照樣品ΔCT，未知樣品ΔCT=CT目的基因-CT管家基因，參照樣品ΔCT=CT參照樣品目的基因-CT參照樣品管家基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸測(cè)定方法的建立

L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的C18-HPLC色譜結(jié)果如圖2所示。以L-精氨酸衍生物的峰面積為橫坐標(biāo)，L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo)得到的線性回歸方程為y=6.1×105x-196 18，r2=0.998。結(jié)果表明，L-精氨酸質(zhì)量濃度在0.133～4.264 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 不同濃度氯化鈉溶液處理下糞腸球菌的吸光度變化

由圖3可知，0%、2%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液增長(zhǎng)幅度較大，接種后6～8 h快速增長(zhǎng)，而4%、6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液增長(zhǎng)幅度較平緩，6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的吸光度明顯低于其他組。隨著氯化鈉濃度的升高，糞腸球菌R-612-Z1受到抑制的程度依次增加，4組不同濃度氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液在培養(yǎng)8 h后，最終的吸光度隨氯化鈉溶液濃度的升高而減小，其中最大值是最小值的3.41倍。

2.3 不同濃度氯化鈉溶液處理下發(fā)酵液中殘留精氨酸含量的變化

由圖4可知，菌液中精氨酸的初始濃度為10 mg/mL，不同濃度氯化鈉溶液處理后0～2 h精氨酸含量迅速消耗，0%、2%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的精氨酸含量下降趨勢(shì)基本一致，4%、6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的精氨酸含量下降速度更快，其中6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的精氨酸含量下降速度最快。培養(yǎng)2～6 h下降趨勢(shì)明顯變緩，0%、2%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的精氨酸含量明顯高于4%、6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液，其中6%氯化鈉溶液處理的糞腸球菌R-612-Z1菌液的精氨酸含量最低。培養(yǎng)6～8 h，精氨酸含量趨于穩(wěn)定。

2.4 熒光定量PCR測(cè)定精氨酸脫亞胺酶基因表達(dá)量的變化

精氨酸脫亞胺酶途徑包含3個(gè)反應(yīng)，包括精氨酸脫亞胺酶(由arcA編碼)、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(由argB編碼)和氨基甲酸酯激酶(由arcC編碼)等3種酶，并且完成精氨酸到鳥氨酸、氨氣和CO2的轉(zhuǎn)化。以上各酶的基因處于1個(gè)操縱子上(圖5-A)。因此筆者選擇了精氨酸脫亞胺酶為目標(biāo)物，通過分析其對(duì)應(yīng)基因在不同氯化鈉濃度條件下的表達(dá)量差異來研究精氨酸的代謝情況。結(jié)果(圖5-B)表明，隨著氯化鈉濃度的升高，gDH管家基因的表達(dá)量幾乎無變化，而arcA基因表達(dá)量依次升高，說明高濃度氯化鈉脅迫下糞腸球菌 R-612-Z1中與精氨酸代謝相關(guān)的精氨酸脫亞胺酶基因的表達(dá)量升高，增強(qiáng)了精氨酸的代謝能力。

3 討論

精氨酸脫亞胺酶途徑催化精氨酸產(chǎn)生鳥氨酸、氨氣和CO2，生成1 mol ATP消耗1 mol精氨酸。因此，該途徑是一些微生物主要的能量和碳、氮來源[2-3]。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸脫亞胺酶途徑是馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequissp.zooepidemicus)適應(yīng)環(huán)境pH值變化的主要途徑之一[9]。Vrancken等研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH值決定發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)IMDO 130101通過精氨酸脫亞胺酶途徑產(chǎn)生瓜氨酸和鳥氨酸的含量[6]。以上研究都說明，精氨酸脫亞胺酶途徑是細(xì)菌適應(yīng)酸性環(huán)境的一個(gè)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然在高鹽濃度下糞腸球菌R-612-Z1的生長(zhǎng)變得緩慢，但是發(fā)酵液中殘留的精氨酸的含量卻急劇減少，說明菌體在高鹽環(huán)境下代謝精氨酸的能力提高，因此推斷精氨酸脫亞胺酶途徑也是糞腸球菌R-612-Z1適應(yīng)高鹽環(huán)境的一個(gè)機(jī)制。目前有關(guān)精氨酸脫亞胺酶途徑在細(xì)菌鹽脅迫中作用的文獻(xiàn)報(bào)道較少，有研究者在植物鹽脅迫中發(fā)現(xiàn)，瓜氨酸是甜瓜耐鹽堿和干旱脅迫時(shí)葉片中的一個(gè)重要生化指標(biāo)[10]。Vrancken等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌IMDO 130101中精氨酸脫亞胺酶通路的活性與培養(yǎng)環(huán)境中的鹽濃度有關(guān)[11]，說明精氨酸脫亞胺酶途徑在細(xì)菌適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的過程中也起著重要作用。

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