王帥兵， 熊良偉， 朱善元，2， 徐建生， 吳海波， 王 婧， 張 龍

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是廣泛存在于水體中的一種正常共棲菌，有致病菌和非致病菌之分。致病性嗜水氣單胞菌是水生動物細(xì)菌性疾病的主要病原之一，可引起魚、蛙、鱉等水生動物出血性敗血癥[1]。近年來，該病在我國各地廣泛流行，大規(guī)模暴發(fā)，死亡率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。使用抗菌藥是目前防治水生動物細(xì)菌性疾病的主要手段。然而，大量研究證明，嗜水氣單胞菌已對多種藥物產(chǎn)生耐藥性[2-3]，給水生動物疾病防治帶來困難。

本試驗(yàn)從江蘇、上海等不同地區(qū)疑似嗜水氣單胞菌病的水生動物采集病料，進(jìn)行細(xì)菌分離，以嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株為參照，經(jīng)鑒定獲得4個不同來源的嗜水氣單胞菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并作比較分析，為有效防治嗜水氣單胞菌病、監(jiān)控嗜水氣單胞菌的耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

細(xì)菌生化反應(yīng)微量、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、AHM鑒別培養(yǎng)基、5%兔血平板、1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)用動物

異育銀鯽，約100 g/尾，購自江蘇省泰州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場，購回后在實(shí)驗(yàn)室訓(xùn)養(yǎng)、觀察1周無異常情況，備用。

1.3 病原菌的分離與純培養(yǎng)

無菌操作取疑似出血病的魚病灶組織(血液、肺、肝胰腺、腎臟等)，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，分別挑取可疑菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

挑取革蘭氏鏡檢為陰性短桿菌的疑似菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上多次劃線純化，直至得到形態(tài)一致、特征穩(wěn)定的菌落。選取單個菌落轉(zhuǎn)接到瓊脂斜面28 ℃培養(yǎng)18 h，置4 ℃冰箱保存、編號備用。

1.4 革蘭氏染色及生理生化特性試驗(yàn)

分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株分別連續(xù)單傳3代純培養(yǎng)后挑取單個菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，穿刺接種AHM培養(yǎng)基及接種微量生化管，按常規(guī)方法進(jìn)行AHM鑒別培養(yǎng)、氧化酶試驗(yàn)及吲哚、甲基紅、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等生化鑒定。

1.5 菌株的致病性鑒別

1.5.1 溶血試驗(yàn)和溶蛋白試驗(yàn) 取純培后的單個菌落分別劃線接種于5%無菌兔血平板和1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，置28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察溶血情況和溶蛋白情況。兔血平板上若在菌落周圍形成不透明的草綠色溶血環(huán)，認(rèn)定為α溶血；若在菌落周圍形成清晰、完全透明的溶血環(huán)，則認(rèn)定為β溶血；若菌落周圍無溶血現(xiàn)象，則認(rèn)定為γ溶血。1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板若菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，則認(rèn)定為陽性，否則為陰性。

1.5.2 毒力因子提取與檢測 (1)Aer毒素的提取與檢測。各菌株接種到肉湯培養(yǎng)基后28 ℃培養(yǎng)48～60 h，4 500 r/min離心，取上清。參照文獻(xiàn)[4]的方法，先用20%飽和度硫酸銨在 4 ℃ 沉淀4 h，5 000 r/min離心后取上清，再用60%飽和度硫酸銨沉淀，4 ℃過夜，5 000 r/min離心，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.8～8.0)溶解后透析2 d，12 000 r/min離心 5 min，上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

(2)胞外蛋白酶(ECPase)的提取與檢測。各菌株分別用肉湯培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)48～60 h，4 500 r/min離心，取上清，參照文獻(xiàn)[5]的方法，用70%飽和度硫酸銨沉淀，4 ℃過夜，5 000 r/min 離心，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值7.8～8.0)溶解并透析2 d，12 000 r/min離心5 min，上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。

1.5.3 回歸感染試驗(yàn) 嗜水氣單胞菌接種于瓊脂平板，于28 ℃培養(yǎng)18～20 h，挑取單個菌落接種于瓊脂平板擴(kuò)大培養(yǎng)18～24 h。無菌條件下向培養(yǎng)皿中加入少量無菌生理鹽水，用玻璃刮仔細(xì)刮下菌苔。離心，取沉淀用生理鹽水洗滌2次。用1 mL生理鹽水懸浮，分光光度法測菌液濃度后，用無菌肉湯培養(yǎng)基分別調(diào)整菌濃度至1×108CFU/mL。將2種濃度的菌液肌肉注射進(jìn)行攻菌，劑量為1 mL/尾[6]，同時用無菌肉湯培養(yǎng)基作陰性對照。10尾魚/組，每天換水1/3，每3～4 h觀察并記錄死亡情況，對死亡魚進(jìn)行解剖和病原再分離，以確定是否由攻毒活菌引起死亡。

1.6 藥敏試驗(yàn)

按K-B藥敏紙片擴(kuò)散法[7]進(jìn)行操作，取單個菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝弧Ｓ脽o菌棉拭子蘸取調(diào)整好的菌液于管壁擠去多余液體，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，待培養(yǎng)基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養(yǎng)基表面，各紙片的中心距離不小于24 mm，紙片距培養(yǎng)皿邊緣的距離不小于15 mm。于28 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷分離菌株對藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察及AHM鑒別反應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)株及4株分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)24 h后生長良好，標(biāo)準(zhǔn)株及4個菌株菌落特征均為圓形、表面光滑、中央凸起、邊緣整齊、白色、不透明、大小約2 mm。在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基明顯變渾濁，試管底部有乳白色沉淀，輕搖后乳白色沉淀均勻懸浮。取瓊脂培養(yǎng)基上的單個菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢均可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌，判定為革蘭氏陰性桿菌。4株分離菌在AHM鑒定培養(yǎng)基上沿穿刺線呈刷狀生長(運(yùn)動力為陽性)，培養(yǎng)基頂部顯紫色，底部為淡黃色，與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株特性一致。標(biāo)準(zhǔn)株及4株分離菌編號及來源見表1。

表1 5株分離菌的編號及來源

2.2 分離菌株生理生化特性

篩選出的4株分離菌吲哚、氧化酶試驗(yàn)均呈陽性。葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等糖發(fā)酵試驗(yàn)均呈陽性，不能利用乳糖和鳥氨酸，與標(biāo)準(zhǔn)株反應(yīng)一致，符合致病性嗜水氣單胞菌特性[8]。生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3 分離菌株致病性及毒力因子檢測結(jié)果

4個分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)株溶血試驗(yàn)均表現(xiàn)為β溶血，溶蛋白試驗(yàn)均可見明顯的溶蛋白圈，表明分離菌及標(biāo)準(zhǔn)株均具致病性(表3)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。

表3 5株分離菌的毒性試驗(yàn)結(jié)果

提取毒力因子Aer毒素和ECPase，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后均可找到相應(yīng)條帶，各菌株的Aer毒素約為45 ku，雜帶少；各菌株的ECPase約為35 ku，雜帶相對較多。SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖1、圖2。

2.4 回歸試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組鯽魚在接種感染后12 h表現(xiàn)出游動變緩、攝食減少或拒食現(xiàn)象，此后相繼出現(xiàn)體平衡能力減弱、廢食等現(xiàn)象，在接種后3～5 d開始出現(xiàn)明顯死亡，到7 d時死亡率均達(dá)60%以上，陰性對照組在試驗(yàn)期內(nèi)正常存活，未出現(xiàn)死亡(表4)。對感染死亡的魚進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定，結(jié)果與嗜水氣單胞菌特征一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4個菌株及標(biāo)準(zhǔn)株對14種抗菌藥物敏感性結(jié)果見表5。由表5可知，包括標(biāo)準(zhǔn)菌株在內(nèi)的5個菌株對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考均表現(xiàn)出高度敏感性；對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環(huán)素基本不敏感；5個菌株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、 復(fù)方新諾明的敏感性表現(xiàn)不盡相同，對鏈霉素、慶大霉素總體表現(xiàn)敏感，對阿奇霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明均表現(xiàn)出一定的耐藥性。

表4 分離菌株對健康鯽魚的感染試驗(yàn)結(jié)果

表5 嗜水氣單胞菌對14種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 分析與討論

嗜水氣單胞菌有致病菌和非致病菌之分，致病菌可引起多種水生動物流行性傳染病的暴發(fā)，其致病性與毒力因子有關(guān)，目前已知的毒力因子主要有以Aer毒素為主的外毒素、胞外蛋白酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號相關(guān)蛋白。Aer毒素是嗜水氣單胞菌引起變溫動物溶血和出血的主要毒力因子，常在胞外蛋白酶的協(xié)同下發(fā)揮致病作用[9]。因此，Aer毒素和ECPase成為鑒別致病性嗜水氣單胞菌的重要依據(jù)。本試驗(yàn)通過提取5個菌株Aer毒素和ECPase并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，均可得到相應(yīng)蛋白條帶。其中，45 ku是弱致病株Aer毒素的特征條帶，35 ku蛋白是胞外蛋白酶被2-巰基乙醇裂解后的產(chǎn)物[10]，為具有典型腸毒素性狀的細(xì)菌外毒素。這進(jìn)一步證實(shí)4個分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株均為致病性嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌引發(fā)的魚類出血病給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，使用抗菌藥物是防治魚類出血病的常用手段。藥敏試驗(yàn)表明，嗜水氣單胞菌對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考普遍敏感，在防治水生動物嗜水氣單胞菌感染疾病時可優(yōu)先選用；對鏈霉素和慶大霉素總體表現(xiàn)敏感，可作為備選藥物。對阿奇霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明部分菌株表現(xiàn)中度敏感，部分存在耐藥性，生產(chǎn)中應(yīng)合理控制、科學(xué)使用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同來源的嗜水氣單胞菌對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環(huán)素均產(chǎn)生耐藥性，與以往報道[11-12]基本一致，生產(chǎn)中應(yīng)避免使用上述藥物。4個分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明的敏感性結(jié)果存在差異，可能因養(yǎng)殖水域、養(yǎng)殖品種、用藥方法和用藥種類不同，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性的藥物種類也不同。防治嗜水氣單胞等引起的細(xì)菌性疾病時，應(yīng)選用高度敏感的藥物，有效控制疾病，減少經(jīng)濟(jì)損失。同時，嚴(yán)格按規(guī)定劑量用藥，注意交替用藥或輪換用藥，避免連續(xù)使用同一藥物或同類藥物，從而避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。此外，使用特異性卵黃抗體、中草藥對嗜水氣單胞菌感染也有一定防治效果[13-14]。

嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，一旦感染引發(fā)疾病則較難控制，因此重在預(yù)防。養(yǎng)殖前期應(yīng)做好魚塘和魚種的消毒工作，養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意控制養(yǎng)殖密度，保持良好的水質(zhì)，保證科學(xué)合理的餌料營養(yǎng)供給，發(fā)現(xiàn)病魚及時隔離和診斷。此外，使用高效的新型疫苗也是預(yù)防嗜水氣單胞菌感染的重要手段。然而，因水生動物給藥的特殊性及病原菌血清型的多樣化[15]，目前使用的菌苗不能獲得理想效果。因此，以細(xì)菌毒力因子為基礎(chǔ)開發(fā)可口服的亞單位疫苗是未來防治嗜水氣單胞菌感染的重要方向。

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