焦美玲， 張 鋼， 孟 昱， 弓瑞娟， 范少然， 崔睿航， 武東霞

(1.河北農業(yè)大學園藝學院，河北保定 071001； 2.河北農業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定 071001)

木本植物在其發(fā)育的年生長周期期間，根系暴露于許多脅迫因子下。在我國北方地區(qū)霜凍是常見的逆境之一，最冷月空氣溫度可能低于-40 ℃，土壤凍結，為了生存，根系需要進行低溫鍛煉。近年來，電阻抗圖譜(electrical impedance spectroscopy，EIS)技術被廣泛用于研究不同器官對非生物脅迫的生理反應，包括冷馴化[1-2]、重金屬脅迫[3]、澇漬脅迫[4]、鹽分敏感度[5]等方面，具有廣泛的應用前景。本研究對根系進行人工冷凍處理，研究電阻抗圖譜參數(shù)結合Logistic方程評價不同月季品種根系的抗寒性，并與傳統(tǒng)的電導法進行比較，結合相對含水量、可溶性糖含量、淀粉含量指標綜合分析、比較品種間的抗寒性差異，以期為月季品種的抗性育種、區(qū)域化栽培、推廣應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為河北農業(yè)大學標本園(115°26′E，38°50′N)內多年生豐花月季品種紅帽、 金瑪麗、柔情似水、仙境，栽培條件一致，常規(guī)養(yǎng)護管理。分別于2015年12月、2016年2月、2016年3月取樣，每個品種選取生長狀況良好的月季6株(每小區(qū)2株)，全株挖出，與土壤分離，帶回。剪下的根用自來水充分淋洗以除去土壤和根表死皮，并剪除須根[6]，選取粗細均勻、無病蟲害、無機械損傷的粗度為2.0～5.0 mm的根段，再用去離子水清洗3遍，吸水紙吸干表面水分備用。

1.2 指標測定(處理方法)

將根系進行人工冷凍處理，以4 ℃為對照，設置6個不同的冷凍溫度，每次取樣處理溫度均為4(對照)、-2、-4、-6、-8、-12、-16 ℃，降溫速率為4 ℃/h，達到指定溫度保持 4 h，在處理完畢的枝條再升溫到4 ℃(升溫速率同降溫速率)，完全解凍后2 h后即可用于電阻抗及相關生理指標的測定。

1.2.1 電阻抗圖譜 每個處理中隨機選取6段15 mm長的根系樣本用作電阻抗測定。參考前人方法[7]，用測厚儀(Mitutoyo No.7331，Japan)測定直徑，精確到0.01 mm，用阻抗儀(Agilent E4980A，USA)測定樣本在42個頻率(80 Hz～1 MHz)下的電阻值和容抗值，作出不同頻率下電阻和容抗的變化曲線，即EIS。月季根系的EIS為單弧，采用分布模型中的單-DCE模型。擬合的參數(shù)為電阻R(Ω)和R1(Ω)、弛豫時間τ、弛豫時間分布系數(shù)ψ；需計算的為胞外電阻率re(Ω·m)、胞內電阻率ri(Ω·m)、低頻電阻率r1(Ω·m)、高頻電阻率r(Ω·m)。

1.2.2 相對電解質滲出率 參照前人方法[8]，將每個處理溫度下根系切取10 mm放入試管，加12 mL去離子水，用保鮮膜將試管口封好，試驗設4次重復。試管放入搖床中振蕩 24 h。用BANTE-950型電導儀(上海般特儀器有限公司)測定初電導值C1和空白對照C空白1，并記錄；C1測定完畢后，再用保鮮膜封口，將試管置于沸水中水浴20 min，自然冷卻后再放入搖床中振蕩24 h，測終電導值C2和C空白2。通過公式(1)計算相對電導率(REL)：

(1)

1.2.3 干物質含量 與EIS測定同步進行。每個品種對照組隨機選取6段15 mm長的根段，然后放入烘箱105 ℃殺青30 min，置于80 ℃下烘干至恒質量，計算相對干物質含量(relative dry matter content，RDMC)：

RDMC= (干質量/鮮質量)×100%。

(2)

1.2.4 可溶性糖含量和淀粉含量的測定 采用蒽酮比色法[9]將根系置于80 ℃烘箱48 h烘干，取出后放于干燥皿里待用。每個月季品種設3次重復。

取磨成粉末的根系樣品0.2 g置于10 mL離心管中，用80%乙醇80 ℃水浴浸提，分設3次離心提取，將3次提取的上清液合并于25 mL容量瓶，用80%乙醇定容。準確吸取0.8 mL溶液于10 mL離心管水浴蒸干，加入5 mL水充分攪拌，使糖完全溶解，離心備用。

向沉淀中加水2 mL，攪拌均勻，在沸水浴中糊化15 min。冷卻后，冰浴中加入9.2 mol/L高氯酸2 mL，攪拌15 min后加水 2 mL 混勻，離心10 min，上清液傾入50 mL容量瓶，再向沉淀中加入4.6 mol/L高氯酸2 mL，攪拌15 min后加水3 mL混勻，離心10 min，然后用水洗(4 mL)沉淀1次，合并各次離心的上清液于上述50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，備用。

向干凈的試管中加入1 mL水，再加入1 mL上述提取液(調零對照加入2 mL水)，冷水中沿壁緩慢加入5 mL硫酸蒽酮混勻，80 ℃水浴中顯色10 min，于620 nm下測定吸光度D值。計算可溶性糖含量和淀粉含量。

1.3 統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2003計算出REL，并將REL所得數(shù)據(jù)隨溫度變化用Microsoft Excel 2003作圖，參照Logistic方程，見式(3)，用SPSS 17.0軟件計算半致死溫度，表征月季根系的抗寒性，給出與Logistic方程的決定系數(shù)r2和線性相關系數(shù)r。通過LEVM 8.06軟件[10]擬合得出EIS參數(shù)值。同樣EIS參數(shù)與溫度參照方程(3)擬合得到半致死溫度，統(tǒng)計EIS各參數(shù)(胞外電阻率re、胞內電阻率ri、弛豫時間τ、弛豫時間分布系數(shù)ψ)及生理指標(相對干物質含量、可溶性糖含量及淀粉含量)的變化，做相關分析，EIS各參數(shù)的解釋參見文獻[11]。

(3)

式中：x為冷凍處理溫度(℃)；y為各EIS參數(shù)(re、ri、τ、ψ)或相對電導率(%)；A+D表示未受凍害時EIS各參數(shù)的基礎值或受凍害時REL的最大值；B為EIS各參數(shù)或REL隨冷凍溫度變化的斜率(%/℃)；C為曲線拐點對應溫度(℃)，即樣本的抗寒性，以LT50表示；D表示受凍害后EIS各參數(shù)的最小值或未受凍害時REL的基礎值。

2 結果與分析

2.1 土壤霜凍期(2月)EIS的變化

研究發(fā)現(xiàn)，4種豐花月季根系的電阻抗圖譜均為單弧，當冷凍處理溫度降至足夠低時，單弧明顯變小，且有變形(變散)的趨勢。其中，金瑪麗和柔情似水變化趨勢較為一致，隨著脅迫溫度的降低，弧度不斷變小，而紅帽和仙境則分別是 -2、-4 ℃弧較對照(4 ℃)大，而后又變小。當弧頂值達到 -15 kΩ 左右時，4種月季的EIS弧度明顯小于各自對照的弧度，可以判定月季根系組織受害，將要或已經達到半致死溫度(圖1)。

2.2 電導法確定半致死溫度

研究發(fā)現(xiàn)，4個品種豐花月季根系的低溫致死曲線都可以和Logistic方程得到很好的擬合，擬合優(yōu)度r2均達到0.80以上，且土壤霜凍期及土壤結凍前均為仙境根系抗寒性最強，最強時可以達到-10.66 ℃，根系抗寒性順序為仙境>紅帽>柔情似水>金瑪麗。而初春土壤解凍后，各品種之間的抗寒性差異不大，但順序有所變化，紅帽最強，而柔情似水最弱(表1)。

2.3 EIS參數(shù)計算半致死溫度

研究發(fā)現(xiàn)，幾乎4個EIS參數(shù)(紅帽3月ψ未估計出)都可以估計出月季根系的抗寒性。re與REL所得抗寒性結果最為接近，基本都是(紅帽3月抗寒性較強)土壤霜凍狀態(tài)下抗寒性最強，2種方法所得抗寒性值相差1～3 ℃。而ri較REL估計的抗寒性普遍偏高，與REL所得抗寒性同樣很接近，但抗寒性結果有所不同，金瑪麗2月抗寒性最弱(表2)。4個品種τ求得的抗寒性與其他方法相差較大。各參數(shù)與REL法測定月季根系抗寒性的相關分析結果顯示出較高的相關性，其中各個品種re法與REL法相關性r2均達到0.62以上，柔情似水的4個參數(shù)的r2均達到0.9以上，顯示出明顯的線性相關性(表3)。

表1 4個豐花月季品種根系半致死溫度變化

表2 4個豐花月季品種EIS各參數(shù)計算出的半致死溫度

表3 REL與EIS各參數(shù)測定的豐花月季根系抗寒性的相關性

2.4 相對干物質含量

研究發(fā)現(xiàn)，金瑪麗和紅帽根系的相對干物質含量(RDMC)明顯低于柔情似水和仙境，不同時期抗寒性強的仙境的RDMC最高值出現(xiàn)在12月，高達46.94%，而金瑪麗最低出現(xiàn)在2月，為36.58%，抗寒性最弱。紅帽和柔情似水的RDMC與其抗寒性結果不一致，但柔情似水的RDMC與其抗寒性有著良好的線性相關性，r2高達0.98(其他品種r2<0.2)(圖2)。

2.5 可溶性糖含量和淀粉含量

研究發(fā)現(xiàn)，4個月季品種根系的可溶性糖含量都是在2月最高，而土壤結凍前的12月和土壤解凍后的3月，其含量明顯低于抗寒性較強的2月，其中2月金瑪麗根系可溶性糖含量顯著低于其他3個品種月季(P<0.05)，而仙境、紅帽和柔情似水之間差異不顯著，但仙境的可溶性糖含量最高，與其抗寒性結果一致。淀粉含量浮動在1%～2.5%，各品種之間沒有明顯差異，但總體上看，土壤霜凍時期淀粉含量要低于其他2個時期(圖3)。

3 討論

朱根海等認為可以用Logistic方程中拐點溫度來確定植物組織受低溫脅迫的半致死溫度(LT50)[12]。低溫脅迫可以使生物膜發(fā)生由液晶相向凝膠相的變化，膜流動性降低，通透性增加，細胞膜透性的改變可以用來表征其結構和功能的受損程度[13]。本研究結果表明，相對電導率及部分EIS參數(shù)可以和Logistic方程得到很好的擬合，re、τ、ψ與溫度呈現(xiàn)線性正相關，所得的半致死溫度在-5.111～-13.911 ℃，而REL和ri同樣遵循“S”形曲線變化，與溫度呈負相關關系。其中re所求半致死溫度估計的抗寒性更是與傳統(tǒng)的相對電導率所得的抗寒性結果完全一致，但是比REL法低0.723～3.054 ℃(2月)，根系抗寒性最強的仙境，二者所得抗寒性相差最大，這與Repo等對歐洲赤松(PinussylvestrisL.)、李亞青等[14]，董勝豪等對白皮松(P.bungeanaZucc.)在抗寒性較強時所得結果[15-16]一致。說明用EIS參數(shù)來判定豐花月季根系的抗寒性相對可靠。

幾個月季根系的電阻抗圖譜均為單弧，與孟昱等在白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)根系上的研究一致，EIS弧的大小變化表明，根系組織的結構及生理生化狀態(tài)在溫度低于某一數(shù)值時發(fā)生改變，遭受凍害以后，弧頂值(絕對值)呈減小趨勢(圖1)，溫度很低時，電阻值和容抗值(絕對值)變得很小且圖譜變散[4]。

植物的含水量與其物質代謝有著密切的關系[17-18]，細胞水分含量是影響抗寒性的重要因素之一，金研銘等研究得出牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)束縛水自由水比值大，抗寒性強的結論[19]。束縛水含量高而自由水含量相對較低即相對干物質含量高，則抗寒性強。本研究中，月季根系相對干物質含量與半致死溫度有一定的線性相關關系，抗寒性強的品種仙境干物質含量高于其他品種。

糖是植物抗寒的主要保護物質，植物體內糖含量高，可以提高原生質濃度，降低細胞液冰點，亦可緩和細胞質過度脫水，保護細胞質膠體不致遇冷凝固[20]。根系組織中積累可溶性糖，維持膜在低溫下的正常功能，而淀粉含量與植物抗寒性同樣有密切關系，但不直接參與滲透調節(jié)，主要通過降解成可溶性糖等物質來間接影響抗寒性。申曉慧等對紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的研究表明，抗寒性強的品種可溶性糖含量在越冬最冷月較高[21]。劉慧民等對繡線菊(SpiraeasalicifoliaL.)的研究也表明可溶性糖含量在眾多指標中與抗寒性關聯(lián)度最大[22]。本研究中月季根系的可溶性糖含量與抗寒性有正相關關系，土壤霜凍期可溶性糖含量高而淀粉含量低。

豐花月季根系處于土壤霜凍狀態(tài)的外環(huán)境時，通過調節(jié)自身水分含量維持低溫狀態(tài)下細胞正常的代謝，同時通過淀粉、蛋白質等大分子物質降解為可溶性糖等物質來調節(jié)細胞滲透壓，從而提高根系的抗寒性。當初春氣溫回升，月季抗寒性相應的減弱，細根明顯增多，可溶性糖、淀粉、水含量等相應的動態(tài)調整，將要或已經為地上部生長做準備。

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