徐 超， 張紅巖， 楊鶴同， 席剛俊

(1.江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省句容市農業(yè)委員會，江蘇句容 212400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物[1]，具有很好的滋陰潤肺、抗衰老、抗腫瘤等功效。成年蘭科植物與真菌共生形成內生菌根是自然界的一種普遍現(xiàn)象。菌根具有促進植株生長、提高植株對干旱等逆境脅迫耐受能力的作用[2]，但是菌根的這種有益作用是否能夠得到充分發(fā)揮，決定于菌根真菌能否對宿主植物進行有效侵染以及菌根真菌的作用效果[2-3]。本試驗對不同接種處理鐵皮石斛的菌根形成狀況及其對改善鐵皮石斛促生、抗旱能力的作用效果進行比較，進而確定優(yōu)良的菌根真菌，以期為進一步開展用菌根提高鐵皮石斛抗旱能力的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種的培養(yǎng)

供試真菌菌株為JSNL001、JSNL002、JSNL003、JSNL004、JSNL005、JSNL006、JSNL007、JSNL008，由江蘇農林職業(yè)技術學院生物工程技術中心于2012年6月在野生鐵皮石斛植株根部組織內分離得到，并保存在實驗室內。將保存的菌根真菌接種到PDA斜面上進行活化；待長滿斜面后，轉接至液體培養(yǎng)基中，在三角瓶內進行搖床培養(yǎng)，制成液體菌劑；同時將該真菌轉接至棉籽殼培養(yǎng)基質中，制成固體菌劑。

1.2 鐵皮石斛菌根化植株的培育

2012年8月，選用粉碎的松樹皮為育苗基質，進行高溫高壓滅菌2 h后，裝盆待用。將長勢基本一致的鐵皮石斛植株馴化苗進行盆栽，每盆栽種1叢，每叢5株。菌劑的施用方式分為固體、液體2種處理。將制備好的液體菌劑、固體菌劑分別施用在基質表面。其中固體菌劑的用量為5 g/盆，液體菌劑的用量為10 mL/盆。施用菌劑后，基質相對含水量在60%以上維持10 d，以確保菌絲在基質內成活。對照處理植株(CK)的接種方式如下：以同樣的接種方式，將等量滅活菌劑接種于鐵皮石斛植株的基質表面。

1.3 鐵皮石斛菌根形態(tài)結構觀察與侵染程度的測定

接種12個月后，用酸性品紅染色法檢查鐵皮石斛菌根的形成狀況，并進行顯微拍照。在每個處理中隨機抽取20株苗，采用顯微觀察法統(tǒng)計菌根感染率和感染指數(shù)。其中，菌根感染率以株為單位進行計算。感染指數(shù)的計算方法為每株苗隨機選取5條1 cm長根段，共計100條根段，按照以下標準進行分級統(tǒng)計：0級，無根段感染或感染率在1%以下；Ⅰ級，感染根段比例為1%～20%；Ⅱ級，感染根段比例為21%～40%；Ⅲ級，感染根段比例為41%～60%；Ⅳ級，感染根段比例為60%以上[4]。

1.4 菌根對鐵皮石斛促生效果的比較

在接種后18個月時，測定不同處理鐵皮石斛的苗高、鮮質量，觀察接種菌根真菌后各處理植株的生長狀況。每個處理測定50株。

1.5 不同處理菌根化鐵皮石斛抗旱能力的比較

選取不同處理的菌根化鐵皮石斛，統(tǒng)一進行澆水，使每盆植株的基質含水量達到飽和，然后在簡易溫室內模擬自然脅迫，使水分不斷消耗，在脅迫后10、20、30 d測定萎蔫度、萎蔫率。溫室內溫度為30～35 ℃，空氣相對濕度為50%～60%。每個處理50株，設3個重復[4]。

按照以下標準對鐵皮石斛的受旱程度進行分級：0級，健康；Ⅰ級，少數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；Ⅱ級，半數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫；Ⅲ級，半數(shù)以上葉片萎蔫；Ⅳ級，整株萎蔫。按以下公式統(tǒng)計各處理植株的萎蔫度和萎蔫率[5]：

萎蔫率=(萎蔫株數(shù)/處理株數(shù))×100%；

萎蔫度=[∑(萎蔫等級×株數(shù))×100]/(萎蔫最高等級×總株數(shù))。

試驗結果用SPSS(V13.0)進行分析，不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

1.6 鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌的鑒定

根據“1.4”“1.5”節(jié)的試驗結果進行分析，確定最佳的鐵皮石斛菌根真菌。通過形態(tài)觀察、內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，簡稱ITS)序列分析等方法，對確定的鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 不同菌根真菌處理鐵皮石斛的菌根化程度比較

表1結果顯示，接種不同菌根真菌后，鐵皮石斛的菌根感染率均為100%。而菌根感染指數(shù)存在較大差異。其中接種JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株菌根感染指數(shù)較高，分別為91.25、97.50、95.00、96.25；接種JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006鐵皮石斛菌根感染指數(shù)稍低，分別為85.00、81.25、90.00、86.25；CK植株未見菌根化現(xiàn)象。

2.2 鐵皮石斛根部組織的菌根化狀況檢測

接種菌根真菌后，真菌菌絲能夠侵入鐵皮石斛的根部組織。菌根化與非菌根化植株的根部組織的外部形態(tài)沒有明顯區(qū)別，兩者之間的主要差異在于根組織內是否有入侵的菌根真菌。鐵皮石斛菌根化以后，在根部細胞間隙中能見到菌絲，同時有分布不勻、形狀不一、著色較深的菌絲結(圖1)，并且經再次分離后，得到了接種菌株。結果表明，接種菌根真菌后，鐵皮石斛的根部組織內確實形成了菌根。

表1 各菌根真菌處理鐵皮石斛的菌根化程度

注：同列數(shù)據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.3 不同處理菌根化鐵皮石斛生長量的比較

本試驗結果表明：接種不同菌根真菌對鐵皮石斛植株苗高和鮮質量的作用效果存在較大差異。其中，接種JSNL004、JSNL003后，對鐵皮石斛的作用效果較為顯著，苗高增幅分別為10.94%、10.16%，鮮質量增幅分別為8.78%、6.87%；其次是接種JSNL007、JSNL008的植株，苗高增幅分別為8.59%、10.16%，鮮質量增幅分別為5.34%、3.82%；接種JSNL006的植株效果稍差；而接種JSNL001、JSNL002、JSNL005的植株效果明顯較差，接種后均對苗高或鮮質量有不同程度的抑制作用(表2)。綜合以上結果可以看出，菌根真菌的作用效果排序依次為JSNL004>JSNL003>JSNL007、JSNL008>JSNL006>JSNL005>JSNL001>JSNL002。

表2 各菌根真菌處理鐵皮石斛的生長量比較

2.4 不同處理菌根化鐵皮石斛抗旱能力的比較

在干旱脅迫后10、20、30 d分別對不同菌根化鐵皮石斛的抗旱能力進行比較，結果(表3)表明，不同菌根化鐵皮石斛間抗旱能力存在較大差異。在干旱脅迫過程中，接種JSNL001、JSNL002、JSNL005、JSNL006的植株和CK植株的萎蔫率、萎蔫度均較高，抗旱能力較差；接種JSNL003、JSNL004、JSNL007、JSNL008的植株抗旱能力較強，在干旱脅迫30 d時，雖然萎蔫率也達到100%，但萎蔫度相對較低，分別為 42.4、40.1、43.4、42.3，顯著低于其他處理的植株。因此認為，不同菌根化鐵皮石斛的抗旱能力排序為JSNL004>JSNL008>JSNL003>JSNL007>JSNL002>JSNL005>JSNL001>JSNL006>CK。

2.5 優(yōu)良菌根真菌的鑒定

根據前期試驗結果，對確認的鐵皮石斛優(yōu)良菌根真菌JSNL004進行鑒定。經過形態(tài)學觀察，JSNL004的菌落特征如下：在PDA平板上培養(yǎng)，菌絲致密，附于基物表面；正面為白色菌落邊緣全緣；反面白色至淡黃色，略有色素沉積(圖2)。PCR擴增得到的內轉錄間隔區(qū)(ITS)全序列如下：

5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAG AGAAATCTTTCAACACTGAAAGATCTTTTCCTTTGTGCTGGCT TTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTTAAAATGGTTCGCAAGGG CCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAATTTTTTCTG AACAATTAAACAAAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA

TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGA

GGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACACCTAAC

CTTTGGGTTTATGGCGTGGAATTGGAATGCGCCGACTGTCATG

GTTGGCCCTTCTAAAATGTAGTTCTTGGCTGTCACCTAATACA

GCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGGCATTCATTGTCAAATCTTTGG

CTAACATTTGCTCCAGGAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACT

CATTCAAATTTTGATCTGAAATCAGGTAGGGCTACCCGCTGAA

CTTAAGCATATCAATAAGCG-3′。結合形態(tài)學鑒定及分子鑒定結果，確定優(yōu)良菌根真菌JSNL004為接合菌亞門毛霉目傘形霉屬矮小傘霉(Umbelopsisnana)。

表3 各菌根真菌處理鐵皮石斛抗旱能力的比較

3 結論與討論

不同菌根真菌對植物的感染率和感染指數(shù)影響較大，只有各種菌根真菌與宿主在可親和的條件下才能侵染成功，親和力愈強，形成菌根的狀況愈好，反之就愈差[6]。本研究表明，接種菌根真菌以后，鐵皮石斛能夠形成菌根，但不同菌根真菌的感染指數(shù)存在較大差異，其中，接種菌根真菌JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的感染指數(shù)都較高，均超過90%，這可能與各菌根真菌與鐵皮石斛間的親和力、不同菌根真菌的菌絲活力存在差異有關。宋微等研究發(fā)現(xiàn)，促生效果越好的菌根真菌，形成的菌根化植株對干旱脅迫的耐受性越強[7]。在本研究中，隨著脅迫程度的加劇，接種JSNL004、JSNL008、JSNL003、JSNL007的鐵皮石斛依次表現(xiàn)出較強的抗旱性，這4種菌根真菌對鐵皮石斛植株苗高的促生作用均較為明顯，但彼此之間對植株鮮質量的影響存在較大差異，其中JSNL004對植株鮮質量的影響最明顯。綜合不同菌根真菌對鐵皮石斛植株的感染指數(shù)、促生、抗旱等指標的影響，認為菌根真菌矮小傘霉(JSNL004)為適用于鐵皮石斛的優(yōu)良菌根真菌，可以為今后制備鐵皮石斛專用生物菌肥提供參考。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第19卷)[M]. 北京：科學出版社，1999：117.

[2]金 輝，許忠祥，陳金花，等. 鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用[J]. 植物生態(tài)學報，2009，33(3)：433-441.

[3]崔 虹，宋希強. 菌根真菌對春石斛幼苗生長發(fā)育的影響[J]. 西南林業(yè)大學學報，2011，31(2)：20-23，32.

[4]徐 超. 外生菌根提高鐵皮石斛抗旱機理研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2010.

[5]徐 超，吳小芹. 菌根化馬尾松對干旱脅迫的響應及其內源多胺的變化[J]. 西北植物學報，2009，29(2)：296-301.

[6]孫民琴. 松樹外生菌根的合成及其對松樹生長與抗性的影響[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2005.

[7]宋 微，吳小芹. 13種菌根真菌對松苗生長及耐旱性的影響[J]. 林業(yè)實用技術，2009(4)：6-8.