潘 梅， 黃 賽， 楊 珺， 戚華沙， 符瑞侃， 王景飛， 呂德任

(海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶園藝研究所，?？?571100)

土田七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Baker) Craib ex Loesener]是姜目姜科土田七屬多年生直立草本植物，植株高20～30 cm，葉基生，披針形，葉面深綠色，葉背綠色或淡紫紅色；花序從根莖抽出，10～15朵花聚生于鐘狀的總苞內(nèi)，花白色，唇瓣中央具杏黃色斑。花期5—7月，分布于我國海南、廣東、廣西和福建，生于海拔800～900 m的林下、荒坡蔭濕處[1]。土田七株形好，葉美麗可賞，花奇特，根莖具芳香味，是極好的林下地被和盆栽觀葉觀花植物。目前土田七仍處于野生狀態(tài)，用根莖進行繁殖，繁殖速度慢。組織培養(yǎng)技術(shù)是快速繁育種苗和保護資源最為有效的方法。目前未見有土田七組織培養(yǎng)與快速繁殖的報道，土田七屬其他植物的組培快繁也未見有報道。無機鹽和植物生長調(diào)節(jié)劑對植物的離體繁殖有著重要的影響，直接影響到培養(yǎng)物的培養(yǎng)效果。本研究通過比較無機鹽和植物生長調(diào)節(jié)劑對土田七芽增殖及生根的影響，以建立土田七的快速繁殖技術(shù)，為其規(guī)?；a(chǎn)提供種苗。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為土田七莖尖，取自海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶園藝研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與誘導 于晴天取土田七莖段，在流水下沖洗干凈，剝?nèi)ト~片切取帶莖尖長約3 cm的小段，用洗潔精液浸泡10 min，清洗后移入超凈工作臺上，先用75%乙醇振蕩30 s，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，最后用無菌水沖洗5次。以MS+0.5 mg/L NAA作為基本培養(yǎng)基，設置6-BA 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L共5個處理，切除底部保留帶莖尖長約1.5 cm的小段，接入誘導培養(yǎng)基中，每種處理接種25瓶，每瓶接入1個外植物體，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計芽數(shù)。

1.2.2 不同MS無機鹽濃度對芽增殖的影響 設置5種MS無機鹽濃度，即1/4、1/2、3/4、1、3/2倍MS，分別添加6-BA 2.0 mg/L，共5種處理。每種處理接種10瓶，每瓶3個單芽，3次重復，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計芽增殖系數(shù)。

1.2.3 不同6-BA與NAA組合對芽增殖的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，設計6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L)與NAA(0、0.2、0.5 mg/L)不同配比，共15種處理。每種處理接種10瓶，每瓶3個單芽，3次重復，30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.4 不同MS無機鹽濃度對小苗生根的影響 設置4種MS無機鹽濃度，即1/4、1/2、3/4、1倍MS，分別添加NAA 0.5 mg/L，共4個處理。將高度約3 cm的小苗接入各處理培養(yǎng)基上，3次重復，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根率、株高、平均根數(shù)和最長根。

1.2.5 不同生長素及濃度對小苗生根的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，設置NAA(0.2、0.4、0.6 mg/L)與IBA(0、0.1、0.2 mg/L)的不同配比，以不添加生長素的培養(yǎng)基作為對照，共7種處理。將高度達到3 cm的小苗接入各種生根培養(yǎng)基上，比較根系分化情況。每種處理接種10瓶，每瓶3株，3次重復，30 d后統(tǒng)計生根率、株高和平均根數(shù)。

1.2.6 生根苗的煉苗與移栽 將培養(yǎng)30 d根系發(fā)達的土田七組培苗移入蔭棚，煉苗5 d后，取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移入基質(zhì)中，澆水淋透，適當遮蔭保濕，30 d后統(tǒng)計植株的成活率。

1.3 培養(yǎng)條件

材料接入培養(yǎng)基后移入培養(yǎng)室，光照度為1 500 lx，光照時間9 h/d，溫度(26±2)℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同6-BA濃度對叢生芽誘導的影響

從表1可知，隨著6-BA濃度的升高，誘導芽數(shù)呈先升高后降低的趨勢。6-BA濃度為1.0 mg/L時，莖尖外植體只是抽長，基部無新芽分化；6-BA為2.0、3.0 mg/L時，平均芽數(shù)分別為2.84、2.80個，芽生長正常；6-BA濃度升高到 4.0 mg/L 時，平均芽數(shù)下降為2.68個，且芽較短；6-BA濃度增高至5.0 mg/L時，分化芽繼續(xù)降低，且芽細?？梢?，誘導叢生芽較好的6-BA濃度為2.0～3.0 mg/L。

表1 不同6-BA濃度對叢生芽誘導的影響

2.2 不同倍量MS培養(yǎng)基對叢生芽增殖的效果

從表2看出，不同倍量MS培養(yǎng)基對土田七叢生芽增殖的影響不同。在1/4～1倍的MS，叢生芽的增殖系數(shù)與無機鹽的用量成正比，全量MS時，叢生芽的增殖系數(shù)最大值，為3.11，當無機鹽用量繼續(xù)增大到3/2 MS時，叢生芽的增殖系數(shù)減小，為2.42。從芽的生長情況看，1/4 MS培養(yǎng)基的叢生芽長勢較差，芽細小，有少量葉片呈黃色，其中2芽心葉枯死，隨著培養(yǎng)時間的延長，黃化葉的數(shù)量增多，黃化程度加重；1/2 MS 培養(yǎng)基的叢生芽長勢也較差，芽較細小，少數(shù)葉片的上半部出現(xiàn)淡黃色斑點，以后葉片出現(xiàn)慢慢變黃；3/4 MS培養(yǎng)基的叢生芽稍粗，葉色綠；MS培養(yǎng)基的叢生芽生長健壯，芽長，葉色綠；3/2 MS培養(yǎng)基的叢生芽也生長良好，葉呈綠色，但芽較MS的略短。從數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果看，MS與其他無機鹽處理之間的差異達到顯著水平，因此，宜選用全量MS進行土田七叢生芽的增殖培養(yǎng)。

表2 不同MS無機鹽用量對叢生芽增殖的影響

注：同列數(shù)值后不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。下表同。

2.3 6-BA與NAA配比對叢生芽增殖的影響

從表3可以看出，單獨使用6-BA，在0.5～3.0 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的升高，芽的增殖系數(shù)也提高，6-BA濃度達到4.0 mg/L時，芽的增殖系數(shù)下降。6-BA 0.5～1.0 mg/L 時，與NAA各組合的芽增殖系數(shù)均在2左右，同一6-BA濃度的組合多差異不顯著，但叢生芽的生長狀況差異較大，不含NAA的培養(yǎng)基中生長的叢生芽粗，基部根很少，而含有0.2 、0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基誘導的芽較細，根系多。當6-BA為2.0 mg/L時，與NAA配比的2個組合的增殖系數(shù)大于單一的6-BA處理，各組合的芽增殖系數(shù)在3以上，但3者無顯著性差異，其芽生長健壯，基部不同程度地生根；6-BA 增加至3.0 mg/L時，各處理培養(yǎng)基所培養(yǎng)的分化芽增殖系數(shù)都較高，6-BA與0.2 mg/L NAA配合時芽的增殖系數(shù)最大，達4.32，且芽生長勢好(圖1)。但當6-BA濃度達到 4.0 mg/L 時，芽的增殖系數(shù)反而下降到2.56～3.16，芽的生長勢也較差，芽多細小，平均芽高 1.6 cm，不利于后續(xù)的生根培養(yǎng)。綜合看來，土田七叢生芽增殖的適宜配方是MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖。

表3 生長調(diào)節(jié)劑組合對芽增殖的影響

2.4 不同倍性MS培養(yǎng)基對再生芽生根的影響

土田七再生芽接入生根培養(yǎng)基中，1/2MS培養(yǎng)基最早發(fā)根，5 d 長出新根，1/4MS于培養(yǎng)7 d長根，3/4MS和MS則培養(yǎng) 8 d 后開始長根，培養(yǎng)30 d后4種培養(yǎng)基中的小苗生根率均達到100%。從表4可以看出，1/4MS處理植株的生長表現(xiàn)差，葉片和葉柄黃化，植株較矮小，平均株高只有6.50 cm，根數(shù)少，平均每株生根8.11條，誘導的根系也較短(圖2)。1/2 MS的植株葉片也有少量的黃化現(xiàn)象(圖3)，但生根數(shù)最多，達到10.19條，其株高最高，為8.25 cm，這可能與根系早發(fā)且多有利于吸收營養(yǎng)從而促進植株的生長有關(guān)。3/4 MS和MS培養(yǎng)的植株無明顯差異，植株生長勢好，葉色綠(圖4)，平均株高7.95、8.13 cm，誘導的根數(shù)分別為9.31、9.45條，平均根長2.38、2.52 cm，但培養(yǎng)時間延長至45 d后，3/4 MS上的植株葉片葉梢開始變黃，以后逐漸增多，而MS培養(yǎng)的植株60 d后仍為綠色。方差分析結(jié)果表明，1/4 MS與1/2MS、3/4MS、MS 3種處理在株高、根數(shù)和根間存在顯著性差異；1/2 MS的根數(shù)顯著高于3/4MS和MS，株高和根最長則差異不顯著，但1/2 MS植株葉片有黃化現(xiàn)象，說明土田七所需的無機鹽濃度較高，1/2 MS無機鹽濃度不能滿足植株生長需求，以 3/4MS～MS為適宜濃度，從規(guī)?；a(chǎn)成本考慮，宜選用3/4 MS，如延長培養(yǎng)周期，則可選用MS，全量的無機鹽濃度可以滿足植株較長時間的營養(yǎng)，保證植株的質(zhì)量。

2.5 不同生長素培養(yǎng)基對再生芽生根的影響

土田七小苗較易生根，在無生長素的培養(yǎng)基中，小苗生根率也能達到100%，但發(fā)根較慢，根數(shù)少，平均每株生根5.52條，長出的根較短細，植株較矮小，最小株高只有4 cm，平均株高6.48 cm(表5)。含生長素的培養(yǎng)基，植株長勢良好，株高最小值為7.21 cm，最高的達到8.16 cm；單一使用NAA，株高與NAA濃度成正比；NAA與IBA 0.1 mg/L配合時，株高值也隨著NAA濃度的升高而加大；當IBA 0.2 mg/L時，以 0.2 mg/L NAA時的株高為最大。就生根數(shù)量來看，在一定的范圍內(nèi)，植株的根系發(fā)生似乎與生長素的絕對值(總含量成正比，在0.2～0.6 mg/L的濃度之間，隨著生長素濃度的加大，生根數(shù)量增多，0.6 mg/L NAA對根系的發(fā)生影響最大，根數(shù)達到9.74條，植株健壯(圖4)；0.6 mg/L NAA與IBA配合，誘導的根數(shù)減少。從根系的生長情況看，低濃度誘導的根系較為細長，生長素濃度達到0.4 mg/L后，生成的根粗且長。差異顯著性分析表明，0.6 mg/L NAA、0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA、0.4 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA 3個處理間的差異不顯著，但3者與其他生長素處理間則多存在顯著性差異。綜合考慮，MS+0.6 mg/L NAA+30 g/L蔗糖應是土田七的最佳誘根培養(yǎng)基，采用MS+0.4 mg/L NAA+0.1～0.2 mg/L IBA+30g/L蔗糖也有良好的效果。

表4 不同無機鹽濃度對生根的影響

表5 不同生長素濃度對根系分化的的影響

3 結(jié)論與討論

已有的姜科植物組織培養(yǎng)研究報道中也多采用莖尖或者莖段作為接種外植體直接誘導芽增殖途徑進行繁殖[2-14]。本研究預試驗中曾用土田七的根莖和葉片作為外植體，發(fā)現(xiàn)存在根莖易污染，葉片易褐化且難以誘導出愈傷組織的問題。采用土田七的莖尖作為外植體，由于該材料生長于地上，帶菌量相對較少，且有葉鞘包裹，感染雜菌的概率低，加之莖尖外表較光滑，消毒效果好，材料污染率低。莖尖基部幼芽長出快，數(shù)量多，這可能與莖尖組織分生能力強，生長速度快有著一定的關(guān)系[15]，因此，莖尖是土田七組培快繁理想的外植體材料。

適宜的無機鹽濃度是培養(yǎng)中的細胞所必需的，然而不同植物的芽苗對其無機鹽濃度的要求不一致。姜科植物組織培養(yǎng)研究報道中多采用MS培養(yǎng)基進行芽的誘導和增殖，生根培養(yǎng)階段不同的姜科種類對無機鹽的要求有所不同。戚華沙等在姜黃的離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，1/2MS、3/4MS、MS等3種無機鹽濃度對芽增殖系數(shù)的影響差異不顯著，但對芽苗的生長勢有一定的影響，以MS為增殖和生根最佳濃度[14]。范燕萍等在紅球姜的組織培養(yǎng)與快速繁殖中，MS為生根最佳無機鹽濃度[4]。文慧婷等用1/2 MS誘導瓷玫瑰幼芽生根，發(fā)根早，且根多而粗壯[8]。熊友華等用種子胚研究圓瓣姜花的繁殖技術(shù)，認為低無機鹽質(zhì)量濃度的1/2 MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有利于其生根[16]。本研究中，全量的MS無機鹽對土田七芽增殖效果最好，3/4MS～MS可以滿足生根培養(yǎng)的要求。

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、水平以及相互組合的選擇對組織的產(chǎn)生與分化十分重要。6-BA和NAA的組合有利于土田七外植體的芽誘導及芽的增殖，但最佳配比水平有所不同。土田七芽誘導培養(yǎng)試驗中，在0.5 mg/L的NAA條件下，添加不同濃度的6-BA，芽的萌發(fā)率有一定的差別。當添加6-BA濃度為2.0～3.0 mg/L時，有利于新芽的分化，平均每個莖尖可長出近3個幼芽。芽的增殖培養(yǎng)中，3.0 mg/L 6-BA與0.2 mg/L NAA配合時，幼芽多，且粗壯，平均芽增殖系數(shù)達到4.32，該配比是幼芽增殖的最佳組合。

土田七組培苗生根比較容易，即使在無激素環(huán)境下也能夠長出根，但效果較差，低濃度的生長素水平生根效果也較差。單獨使用NAA，濃度為0.6 mg/L時，獲得最佳生根效果，平均生根數(shù)9.74條，根粗壯、發(fā)達，植株長勢好。NAA和IBA配合使用時也能達到良好的效果，適宜的濃度為NAA 0.4 mg/L，IBA 0.1～0.2 mg/L。

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