丁 婷,顧雙月,蘇 博,王 其,陳小潔

( 1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,安徽 合肥 230036；2.安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

植物內(nèi)生菌(Endophyte) 指某一階段或全部階段生活于健康寄主植物的各組織或器官內(nèi)部的真菌、細(xì)菌或放線菌[1-3]，且沒有引起明顯發(fā)病癥狀的微生物，在植物體這一特殊的環(huán)境中，內(nèi)生菌與宿主協(xié)同進(jìn)化，構(gòu)成植物體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)，并對(duì)宿主植物體產(chǎn)生有益的生物學(xué)作用，增強(qiáng)植物抗逆、抗病原真菌和細(xì)菌等能力[2]。相關(guān)報(bào)道表明，在植物病蟲害防治方面應(yīng)用植物內(nèi)生菌可有效增強(qiáng)植物的抗病性[4-15]。

禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麥紋枯病是我國小麥生產(chǎn)上的一種典型土傳病害，病菌在小麥不同生育階段均能造成侵染，形成爛芽、苗枯、爛莖以及枯白穗等癥狀，嚴(yán)重影響小麥的長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量, 近年來，利用植物內(nèi)生菌進(jìn)行小麥紋枯病的生物防治已成為研究的重點(diǎn)[16-22]。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院小麥病害課題組從健康的藥用植物杜仲(Eucommiaulmoides.)莖分離到1 株炭疽菌屬(Colletotrichum)內(nèi)生真菌菌株DZJ07，該菌株對(duì)小麥紋枯病菌有較強(qiáng)的拮抗作用,能夠在小麥根部進(jìn)行有效定殖，通過誘導(dǎo)小麥植株苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶等防御酶活性的提高，提高小麥對(duì)紋枯病的抗病能力[3], 具有重要的理論研究和生產(chǎn)開發(fā)價(jià)值。為了進(jìn)一步研究該菌株的內(nèi)生性，安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用綠色熒光蛋白基因(gfp), 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,篩選具有拮抗活性的綠色熒光蛋白，標(biāo)記轉(zhuǎn)化子，研究該轉(zhuǎn)化子在小麥植株中的定殖能力以及對(duì)小麥紋枯病的生防效果，為深入研究杜仲拮抗內(nèi)生菌與小麥的互作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)供試植物病原真菌、內(nèi)生真菌及質(zhì)粒的特征及來源見表1。PCR膠回收試劑盒、Taq酶和大腸桿菌菌株Trans-1 感受態(tài)等分子生物學(xué)相關(guān)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；根據(jù)gfp基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物：引物1(gfp-R 5′-CGCACTA

GTGTACAGCTCGTCCAT-3′)和引物2(gfp-F 5′-GGGGGATCCATGGTGAGCAAG-3′)，由上海(生工)生物有限公司合成，以gfp1305為模板，以引物1和引物2為上下游引物擴(kuò)增gfp基因。生化試劑：草胺膦購自德國Dr.Ehrensorfer公司，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli)常規(guī)培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，根癌農(nóng)桿菌常規(guī)培養(yǎng)采用YEB培養(yǎng)基，真菌常規(guī)培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。試驗(yàn)用抗生素濃度為卡那霉素50 μg/mL、羧芐青霉素50 μg/mL、噻孢霉素300 μg/mL、草胺膦200 μg/mL。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：削皮馬鈴薯200 g/L(沸水煮20 min左右過濾出湯汁)，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L；LB 培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值調(diào)至7.0；YEB培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/L，七水硫酸鎂 0.9 g/L，pH值調(diào)至7.0～7.4；麥粒培養(yǎng)基：將小麥粒放在水里浸泡48 h后，取適量裝在組培瓶，放在滅菌鍋121 ℃ 60 min滅菌。

IM液體培養(yǎng)基：2.5×基本培養(yǎng)基 80 mL ，葡萄糖 0.36 g，甘油 1 mL，加ddH2O至終體積192 mL，滅菌冷卻到50 ℃左右后添加8 mL 1mol/L MES和4 mL 10 mmol/L AS；2.5×基本培養(yǎng)基：KH2PO43.625 g，K2HPO45.125 g，MgSO4·7H2O 1.250 g，NaCl 0.375 g，CaCl2·2H2O 0.165 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.006 2 g，(NH4)2SO41.250 g，加1 L ddH2O。

固體M-100培養(yǎng)基(1 L)：M-100鹽溶液62.5 mL，葡萄糖10 g，KNO33 g，加ddH2O至1 L，瓊脂粉15 g；半固體M-100培養(yǎng)基的瓊脂的含量為1%。M-100鹽溶液(1 L)：M-100微量元素溶液8 mL，KH2PO416 g，Na2SO44 g，KCl 8 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl21 g，加ddH2O至1 L；M-100微量元素溶液(500 mL)：H3BO330 mg，MnCl2·4H2O 70 mg，ZnCl2200 mg，Na2MoO4·2H2O 20 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 50 mg，CuSO4· 5H2O 200 mg，加ddH2O 500 mL。

表1 細(xì)菌、真菌和質(zhì)粒Tab.1 Bacteria, fungi and plasmids

1.3 綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)載體pDHt-bar- gfp的構(gòu)建

以gfp1305為模板，以引物1和引物2為上下游引物擴(kuò)增gfp基因。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液 5 μL、dNTP 4 μL、模板1 μL、gfp-R 2 μL、gfp-F 2 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O至總體積為50 μL，以94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min為反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物切膠回收，與pDHt-bar質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，對(duì)切膠產(chǎn)物分別回收并連接。雙酶切體系為：pDHt-bar/gfp24 μL、10×通用緩沖液3 μL、BamHⅠ 1.5 μL、SpeⅠ 1.5 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃溫浴過夜；連接體系為：pDHt-bar 2 μL、gfp6 μL、10×Buffer 1 μL、T4DNA 連接酶1 μL，16 ℃連接3 h。將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌Trans-1，隨機(jī)挑取單克隆子并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 質(zhì)粒pDHt-bar-gfp轉(zhuǎn)化生防真菌DZJ07及轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)

1.4.1 質(zhì)粒pDHt-bar-gfp轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞[23]取0.5 μL pDHt-bar-gfp質(zhì)粒加入置于冰上的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；液氮速凍后在37 ℃條件下溫育5 min，溫育完成立即冰?。患尤脒m量YEB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 h，離心收集菌體；去掉上清后用適量液體YEB重懸菌體并均勻涂布在含有抗生素Carb和Kan 的YEB平板上，室溫培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證[23]，并將其菌液保存于-80 ℃。

1.4.2 根癌農(nóng)桿菌與生防真菌DZJ07分生孢子孢懸液共培養(yǎng) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)入pDHt-bar-gfp質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌并制備生防真菌DZJ07分生孢子孢懸液，將孢子懸液調(diào)到1×106cfu/mL濃度，使其進(jìn)行共培養(yǎng)[23]，操作方法：培養(yǎng)轉(zhuǎn)入pDHt-bar-gfp質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌，離心收集菌體；用適量的IM液體培養(yǎng)基重懸菌體，并將菌液濃度調(diào)到OD660為0.15，搖床培養(yǎng)6 h左右；取培養(yǎng)好的根癌農(nóng)桿菌菌液及制備好的孢懸液各100 μL 充分混合均勻，涂布于IM固體培養(yǎng)基平板，共培養(yǎng)2 d；加入適量含噻孢霉素和草胺膦的半固體M-100培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d至抗性菌落出現(xiàn)；挑取疑似轉(zhuǎn)化子邊緣部分轉(zhuǎn)移到含噻孢霉素和草胺膦的M-100固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d，挑取抗性菌落(轉(zhuǎn)化子)，用試劑盒提取基因組并進(jìn)行初步PCR驗(yàn)證，取菌絲體在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，綠色熒光標(biāo)記。

1.4.3 轉(zhuǎn)化子熒光觀察 將按照1.4.2方法獲得的多株轉(zhuǎn)化子以及原始菌株DZJ07分別接種于PDA 固體平板，光照培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)7 d后 觀察其菌落生長(zhǎng)狀況；并在Leica DM5000B顯微鏡(Germany)下, 利用波長(zhǎng)為450～ 490 nm 的激發(fā)光照射不同轉(zhuǎn)化子及原始菌株的菌絲，觀察熒光產(chǎn)生情況。

1.5 熒光轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定

采用植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根公司)提取熒光轉(zhuǎn)化子菌絲的DNA進(jìn)行熒光轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定。采用并建立如下的標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min； 94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，2 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。用表2標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系來完成。

表2 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系Tab.2 Standard PCR reaction amplification system

1.6 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)化子接種至不含抗生素的PDA固體平板，28 ℃繼代培養(yǎng)10代后，重新轉(zhuǎn)接至含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA固體平板上，觀察菌體生長(zhǎng)及其熒光產(chǎn)生情況。

1.7 熒光轉(zhuǎn)化子的拮抗活性測(cè)定

首先將原始菌株DZJ07、熒光轉(zhuǎn)化子及小麥紋枯病菌菌株分別接種到PDA固體平板上28 ℃培養(yǎng)7 d，備用。各熒光轉(zhuǎn)化子的拮抗活性測(cè)定采用平板對(duì)峙法[3]，同時(shí)以單接種病原菌平板為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，置于25 ℃下黑暗恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d，觀察并記錄結(jié)果，計(jì)算抑菌率。

1.8 熒光轉(zhuǎn)化子在小麥植株中的定殖檢測(cè)

1.8.1 熒光轉(zhuǎn)化子分生孢子液的準(zhǔn)備 熒光轉(zhuǎn)化子接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃下暗培養(yǎng)8 d，收集分生孢子，制備孢子懸浮液，通過血球計(jì)數(shù)法調(diào)整分生孢子懸浮液濃度為1.0×107cfu/mL。

1.8.2 麥種處理 揚(yáng)麥158先浸泡于3%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，然后取出，將其用無菌水沖洗3～5遍后，置于無菌培養(yǎng)皿中，于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕催芽，待種子露白后，將其在熒光轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液中浸泡5 h，取出備用。

1.8.3 小麥種植[3]小麥采用盆缽(高8 cm，上口徑7 cm,下口徑5 cm)種植，將熒光轉(zhuǎn)化子的麥粒培養(yǎng)物(篩選獲得的具有較佳拮抗活性的熒光轉(zhuǎn)化子接種在麥粒培養(yǎng)基上，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱7 d即為麥粒培養(yǎng)物)與滅菌砂土按1∶5 (m∶V) 的比例混勻，制成菌土裝入盆缽中，播種按1.8.2方法催好芽的麥種，并于麥種表面覆蓋5 cm左右的菌土。以種植于裝有滅菌砂土盆缽中的小麥植株(麥種未經(jīng)熒光轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液浸泡)為陰性對(duì)照。每種處理均種植20盆，每盆5粒麥種，置于人工氣候培養(yǎng)箱(晝夜溫度18 ℃，相對(duì)濕度50%，晝夜各12 h)中培養(yǎng)。

1.8.4 熒光轉(zhuǎn)化子在小麥根際的定殖及數(shù)量檢測(cè)[3]于接種后第9，12，15，18，23，28，34天分別取不同處理組的小麥根系，參照齊永霞等[24-25]方法，利用梯度稀釋法，將獲得的母液依次稀釋至10-3，分別吸取濃度為10-3溶液100 μL涂布于含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，48 h后觀察記載菌落數(shù)，計(jì)算平均每克根際土壤中的含菌量。

1.8.5 熒光轉(zhuǎn)化子在小麥植株的定殖及數(shù)量檢測(cè)[24]于小麥種植后第9，12，15，18，23，28，34天分別進(jìn)行小麥植株的取樣以及熒光轉(zhuǎn)化子的數(shù)量檢測(cè)。樣品經(jīng)下列方法處理：①根內(nèi)定殖：小麥根系用流水沖洗干凈后，再用滅菌水反復(fù)沖洗，徹底去除根際土，根系首先用75%乙醇消毒3 min，后用無菌水沖洗3次。② 莖內(nèi)定殖：小麥莖用75%乙醇消毒3 min，再用無菌水沖洗。定量稱取不同方法處理過的小麥根系、莖組織，于研缽中徹底研磨。研磨液稀釋至10-3，吸取10-3溶液100 μL涂布到已制備好的含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA 平板上。48 h后逐日觀察記載，觀察并計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。

于小麥種植后的第34天，取小麥根、莖組織(每1株苗為一個(gè)重復(fù), 3次重復(fù))，按照上述方法表面滅菌后，將小麥根、莖組織徒手切片，小心鋪展于載玻片上于激發(fā)光波段450～490 nm下進(jìn)行綠色熒光觀察(萊卡DM5000B型號(hào)為DFC425C)。

1.9 熒光轉(zhuǎn)化子對(duì)小麥紋枯病防治效果試驗(yàn)

麥種及小麥種植方法均同1.8.2和1.8.3，試驗(yàn)設(shè)5種處理，具體方法參照文獻(xiàn)[3]，每處理重復(fù)20盆，每盆5粒。播種后35 d 調(diào)查紋枯病的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率。5種處理如下所示：

①陰性對(duì)照處理：將催過芽的麥粒(麥種未經(jīng)孢子懸浮液浸泡)播種于裝有滅菌砂土的盆缽里。

②小麥紋枯病菌 + 原始菌株DZJ07處理：小麥紋枯病(麥粒培養(yǎng)基培養(yǎng))、原始菌株與滅菌砂土按1∶1∶5(m∶m∶V)的比例混合均勻，播種催過芽的麥粒(麥種經(jīng)原始菌株孢子懸浮液(1.0×107cfu/mL)浸泡)。

③小麥紋枯病菌 + DZJ07熒光轉(zhuǎn)化子處理 小麥紋枯病菌(麥粒培養(yǎng)基培養(yǎng))、熒光轉(zhuǎn)化子與滅菌砂土按1∶1∶5(m∶m∶V)的比例混合均勻后，播種催過芽的麥粒(麥種經(jīng)熒光轉(zhuǎn)化子分生孢子懸浮液(1.0×107cfu/mL)浸泡)。

④小麥紋枯病菌處理 小麥紋枯病菌和滅菌砂土按1∶5(m∶V)混合均勻，播種催過芽的麥粒(麥種未經(jīng)孢子懸浮液浸泡)。

⑤小麥紋枯病菌+多菌靈處理 小麥紋枯病菌與滅菌砂土按1∶5(m∶V)混合均勻，多菌靈拌種處理的麥粒播種于盆缽中。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白基因(gfp)表達(dá)載體pDHt-bar-gfp的構(gòu)建

以gfp1305為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物(約750 bp)回收并與pDHt-bar質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌Trans-1，隨機(jī)挑取單克隆子，以gfp-F和gfp-R為上下游引物擴(kuò)增gfp基因。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，顯示克隆轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有750 bp大小的條帶產(chǎn)生，初步推斷重組質(zhì)粒pDHt-bar-gfp構(gòu)建成功。隨后，重組質(zhì)粒pDHt-bar-gfp送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果確認(rèn)綠色熒光蛋白(gfp)表達(dá)載體pDHt-bar-gfp的構(gòu)建成功。

M.DNA Marker(2 000 bp)；1，2. gfp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DNA Marker(2 000 bp)；1，2.PCR amplification products of gfp.

2.2 杜仲內(nèi)生拮抗菌DZJ07熒光轉(zhuǎn)化子的獲得

2.2.1 綠色熒光蛋白基因(gfp)表達(dá)載體pDHt-bar-gfp的轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒pDHt-bar-gfp轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1，過夜培養(yǎng)挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2)，圖2中顯示有750 bp大小的基因條帶，驗(yàn)證pDHt-bar-gfp成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1。將含有重組質(zhì)粒pDHt-bar-gfp的根癌農(nóng)桿菌AGL-1與杜仲內(nèi)生拮抗菌DZJ07分生孢子液共培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)液涂布于M-100固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)3～4 d，復(fù)篩后最終獲得7個(gè)熒光轉(zhuǎn)化子。參照1.4 的方法提取熒光轉(zhuǎn)化子和原始DZJ07菌株的基因組DNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示7個(gè)熒光轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出大小約750 bp 的條帶，而DZJ07沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物，其中2個(gè)轉(zhuǎn)化子DZJ07-1、DZJ07-6的基因組PCR結(jié)果如圖3所示。選取熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-1 、DZJ07-6的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，比對(duì)結(jié)果表明序列與gfp基因編碼區(qū)序列相同，由此可知，外源gfp基因已整合到基因組DNA中。

M.DNA Marker(2 000 bp)；1～8.pDHt-bar-gfp農(nóng)桿菌AGL-1單菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9.pDHt-bar空質(zhì)粒對(duì)照。M.DNA Marker(2 000 bp)；18.PCR amplification products of pDHt-bar-gfp transformant strains;9.pDHt-bar empty plasmid control.

M.DNA Marker (2 000 bp);1～2.轉(zhuǎn)化子DZJ07-1、DZJ07-6基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.DZJ07 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.TE水對(duì)照。

M.DNA Marker (2 000 bp);1-2.PCR amplification products of transformants DZJ07-1,DZJ07-6 genomic;3.PCR amplification product of DZJ07;4.TE water control.

圖3熒光轉(zhuǎn)化子基因PCR驗(yàn)證電泳圖
Fig.3GenomicDNAPCRconfirmationelectrophoresis

2.2.2 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)特性研究 轉(zhuǎn)化子于28 ℃培養(yǎng)7 d后，其菌落顏色、生長(zhǎng)速度及菌絲和分生孢子形態(tài)等均與原始菌株DZJ07一致，可知，外源pDHt-bar質(zhì)粒的插入對(duì)其生長(zhǎng)和生物學(xué)特性沒有影響。熒光觀察表明，在激發(fā)光波長(zhǎng)為450～490 nm的照射下，原始菌株 DZJ07菌絲不產(chǎn)生熒光，而7個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子均能夠產(chǎn)生綠色熒光(圖4)，分別命名為DZJ07-1～DZJ07-7，結(jié)合上述轉(zhuǎn)化子的克隆擴(kuò)增結(jié)果，可知綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)載體pDHt-bar-gfp的成功插入引起轉(zhuǎn)化子綠色熒光的產(chǎn)生。

圖4 標(biāo)記GFP的炭疽菌DZJ07菌絲體的熒光圖Fig.4 Fluorescence of Colletotrichum gloeosporioides DZJ07 mycelium labeled with GFP

2.3 熒光轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性

參照1.6 的方法, 將所獲得的7個(gè)熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-1～DZJ07-7分別在不含抗生素噻孢霉素的PDA 固體平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接10 次后，再接種至含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA固體平板上，各熒光轉(zhuǎn)化子不僅長(zhǎng)勢(shì)正常，且能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生綠色熒光，從而表明表達(dá)載體pDHt-bar-gfp中的gfp基因和噻孢霉素抗性基因在轉(zhuǎn)化子中可穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。

2.4 熒光轉(zhuǎn)化子對(duì)小麥紋枯病菌的拮抗活性

熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-1～DZJ07-7對(duì)小麥紋枯病菌的拮抗活性檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，由表3可知，轉(zhuǎn)化子DZJ07-5和DZJ07-6對(duì)小麥紋枯病菌的拮抗活性略強(qiáng)于原始菌株DZJ07，抑菌率均在50%以上；DZJZ07-1、DZJ07-2和DZJ07-7的拮抗活性比DZJ07稍弱，抑菌率在43.68%～46.11%；而熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-3和DZJ07-4的抑菌率相對(duì)較低，僅在35%左右。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6進(jìn)行小麥植株定殖能力的研究。

A. 培養(yǎng)4 d的小麥紋枯病菌菌落； B.DZJ07與小麥紋枯病菌對(duì)峙培養(yǎng)4 d； C. 熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6與小麥紋枯病菌對(duì)峙培養(yǎng)4 d。A. The colony characteristics of R. cerealis after 4 days; B. Confront antibiotic culture experiment in DZJ07 and R. cerealis after 4 days;C. Confront antibiotic culture experiment in the transformant strains DZJ07-6 and R. cerealis after 4 days.

表3 七個(gè)熒光轉(zhuǎn)化子對(duì)小麥紋枯病菌的抑菌率Tab.3 The inhibition rate of seven fluorescent transformants against wheat Rhizoctonia cerealis %

注：不同小寫字母表示0.05 水平上差異顯著(Duncan多重比較法)。表5同。

Note：Values with different small letters differ significantly at 0.05 level using the Duncan HSD test.The same as Tab.5.

2.5 熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6在小麥中的定殖情況分析

小麥種植后的不同時(shí)間段，對(duì)經(jīng)熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6處理的小麥根際土壤、根和莖組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的分離檢測(cè)，結(jié)果表明(表4)，小麥生長(zhǎng)的第9天可從根際土壤、根和莖組織中分離檢測(cè)到轉(zhuǎn)化子DZJ07-6；隨著小麥植株的生長(zhǎng)，根際土壤中的熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，截至取樣的第34天，小麥根際土壤中的DZJ07-6含量保持在2.72×106cfu/g ；熒光轉(zhuǎn)化子在小麥根、莖內(nèi)的定殖則均呈現(xiàn)出先下降再上升并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，從第9天的最大值緩慢下降，取樣分離的第18，15天，根和莖組織中的熒光轉(zhuǎn)化子數(shù)量分別達(dá)到最低，分別為0.43×104，0.43×103cfu/g，隨后，根、莖組織中的熒光轉(zhuǎn)化子數(shù)量緩慢上升，截至取樣的第34天，小麥根、莖內(nèi)的熒光轉(zhuǎn)化子數(shù)量分別為0.62×104,2.26×103cfu/g。相應(yīng)的對(duì)照處理中，均無DZJ07-6菌株的存在(表4)。熒光顯微觀察結(jié)果如圖6所示，大量DZJ07-6可在小麥根表存活并大量繁殖，且生長(zhǎng)34 d的小麥植株的根、莖組織中含有大量DZJ07-6的發(fā)光菌株，如圖6-A、C所示，而在對(duì)照的根和葉片橫切面中，均未觀察到標(biāo)記菌株(圖6-B、D)。

表4 小麥植株的根際土壤、根和莖組織中熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6的平板分離Tab.4 Platelet separation of fluorescent transformant DZJ07-6 in rhizosphere soil, root and stem tissue of wheat plants cfu/g

注：表中所列數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值。表5同。

Note： The data listed in the table is the average of 3 replicates.The same as Tab.5.

A.熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6的小麥莖組織； B.對(duì)照小麥莖組織；C.熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6的小麥根組織 ；D.對(duì)照小麥根組織。A. Wheat stem tissue of fluorescent transformant DZJ07-6；B. Control wheat stem tissue；C. Wheat root tissue DZJ07-6 of transformant；D. Control wheat root tissue.

2.6 熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6對(duì)苗期盆栽小麥紋枯病的防效

小麥播種35 d后統(tǒng)計(jì)各處理小麥的發(fā)病情況，結(jié)果見表5：小麥紋枯病菌組的小麥患病嚴(yán)重，病情指數(shù)為84.45%；小麥紋枯病菌 + 原始菌株DZJ07處理的小麥與小麥紋枯病菌 + DZJ07熒光轉(zhuǎn)化子組的小麥植株發(fā)病情況相似，病情指數(shù)分別為10.02%，10.87%，無顯著差異，說明熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6對(duì)苗期小麥紋枯病的生防效果沒有因綠色熒光蛋白的標(biāo)記和表達(dá)受到明顯影響。

3 討論

gfp標(biāo)記的方法是研究靶標(biāo)微生物與植物互作關(guān)系的重要手段?，F(xiàn)階段報(bào)道的靶標(biāo)微生物的gfp標(biāo)記方法多為點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化法，如楊秀榮等[26]利用點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化法將含有g(shù)fpmut3a基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生防枯草芽孢桿菌B579中獲得gfp標(biāo)記成功的枯草芽孢桿菌B579-gfp并測(cè)定其定殖能力；李曉婷等[27]采用點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化法將含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒pTRgfp轉(zhuǎn)入假單胞菌解磷細(xì)菌K3中，獲得gfp標(biāo)記成功的菌株K3GFP并測(cè)定其解磷能力；黃貴修等[28]采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將gfp表達(dá)載體質(zhì)粒pPKNTG轉(zhuǎn)入HND5菌株中，獲得穩(wěn)定遺傳的熒光轉(zhuǎn)化子。而有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在生防真菌gfp標(biāo)記方面的應(yīng)用則鮮有報(bào)道，僅有吳磊等[29]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將紅色熒光蛋白基因DsRed轉(zhuǎn)入植物病原菌輪枝鐮孢菌株，觀察其在玉米自交系B73根部的定殖及生長(zhǎng)規(guī)律以及Luo等[30]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究白僵菌代謝產(chǎn)物有絲分裂原活化蛋白激酶作用等方面的報(bào)道。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，獲得了具有拮抗活性的杜仲內(nèi)生真菌DZJ07綠色熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化子，且插入的外源gfp基因和噻孢霉素抗性基因可在轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。本試驗(yàn)獲得的7個(gè)熒光轉(zhuǎn)化子中有2個(gè)轉(zhuǎn)化子的拮抗活性與原始菌株DZJ07相似，而其余的轉(zhuǎn)化子對(duì)小麥紋枯病菌的拮抗活性則顯著降低，究其原因可能是外源基因在微生物體內(nèi)進(jìn)行特性表達(dá)的同時(shí)，也會(huì)改變轉(zhuǎn)化菌株的代謝途徑，增強(qiáng)轉(zhuǎn)化菌株的代謝負(fù)荷，當(dāng)轉(zhuǎn)化菌株和其他微生物共同生長(zhǎng)的情況下，會(huì)處于不利地位，反映在生理特性上，即是轉(zhuǎn)化子拮抗活性的變化或生長(zhǎng)特性等方面的改變。此外，試驗(yàn)中熒光顯微鏡觀察熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6在小麥植株中的定殖情況，發(fā)現(xiàn)其首先侵染玉米根系等組織，并在其中大量增殖，然后沿主根向地上部位莖組織侵染，在玉米莖部組織細(xì)胞間隙間擴(kuò)展，截至取樣的第34天，小麥根、莖內(nèi)的熒光轉(zhuǎn)化子數(shù)量分別為0.62×104，2.26×103cfu/g，說明熒光轉(zhuǎn)化子DZJ07-6在小麥植株中有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可以在小麥根、莖等組織中較好地定殖。

表5 五種不同處理的小麥紋枯病的發(fā)生情況Tab.5 Effect of DZJ07 mycelia on morbidity of Rhizoctonia cerealis

植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物已成為生防研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。內(nèi)生菌能否在土壤或寄主植物中進(jìn)行有效定殖，對(duì)其生防作用的發(fā)揮有著重要的作用。目前，利用gfp標(biāo)記法可對(duì)生防菌在植物體及其根際的定殖、擴(kuò)展和消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行深入研究。如魏春燕等[8]將固氮菌DX120E進(jìn)行了綠色熒光蛋白基因標(biāo)記，并對(duì)其在甘蔗植株內(nèi)的定殖進(jìn)行了分析；田兆豐等[31]對(duì)枯草芽孢桿菌Kct99進(jìn)行了gfp標(biāo)記，并對(duì)其在甘藍(lán)根部的定殖方式進(jìn)行了分析，研究了生防枯草芽孢桿菌的抗病機(jī)理。本研究利用綠色熒光蛋白gfp對(duì)杜仲拮抗內(nèi)生真菌DZJ07進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)外源gfp基因的插入對(duì)生防菌的生物學(xué)特性以及生防特性無不良影響，DZJ07綠色熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化子與原始菌株在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、拮抗活性等方面均有較好的相似性，而且質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性較好，本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開展生防菌、病原菌及寄主植物三者之間的互作研究提供了理論基礎(chǔ)。此外，生防微生物的防治效果易受環(huán)境因素的影響，本研究?jī)H研究了DZJ07熒光轉(zhuǎn)化子對(duì)小麥紋枯病的溫室防效，而其在其他不同氣候條件下如田間環(huán)境中是否依然可以在小麥植株中有效定殖，是否還會(huì)對(duì)小麥紋枯病有較好的防治效果，這些還有待于深入研究。

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