范新陽，張永云，邱立華，陳 濤，周芳廷，哈 福，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南 昆明 650201；3.云南省德宏州芒市畜牧站，云南 芒市 678400)

牛和羊等反芻動物以前腸發(fā)酵的方式從它們的食物中獲取營養(yǎng)物質(zhì)[1]。這種以細(xì)菌進(jìn)行的前腸發(fā)酵，其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸被胃壁吸收，為反芻動物提供能量。為了從這些微生物群體中回收必需的營養(yǎng)物質(zhì)，反芻動物必須破壞細(xì)菌和其他微生物細(xì)胞，釋放內(nèi)容物，之后胃中的胃消化酶從內(nèi)容物中提取營養(yǎng)物質(zhì)[2]。細(xì)菌對于哺乳動物的消化酶普遍具有抗性，因此反芻動物募集一種抗細(xì)菌的溶菌酶來裂解這些前腸微生物[3]。

溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一種抑菌蛋白，它分布于生物體多種體液和組織中，包括禽類蛋清、動物分泌物(如人乳和眼淚)和多形核白細(xì)胞分泌物[4]。LYZ全稱為1，4-O-溶菌酶，是一種低分子量的基礎(chǔ)蛋白，它通過裂解細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵直接溶解革蘭氏陽性細(xì)菌，在分泌型免疫球蛋白A和補(bǔ)體的參與下，也可以間接溶解革蘭氏陰性細(xì)菌[5-6]。動物L(fēng)YZ分為3種：C型、G型和I型，其中溶菌酶C是唯一存在于脊椎動物、原索動物和無脊椎動物的類型，也是目前研究最深入的類型[7]。

迄今，在反芻動物中已經(jīng)鑒定出14種LYZc基因，但只有9個LYZc基因可以編碼出相應(yīng)的功能蛋白，它們之間具有74.8%～97.5%的同源性[8]。胃型LYZc基因是溶菌酶c基因家族的重要成員，它們在反芻動物的胃中高表達(dá)。普通牛胃型LYZc基因共有4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)序列全長為444 bp，編碼147個氨基酸，4個外顯子對應(yīng)的編碼區(qū)大小分別為136，165，76，67 bp。胃型和非胃型LYZ c氨基酸序列雖然相似，但胃型LYZ c發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，等電點(diǎn)變低，能適應(yīng)胃中的酸性環(huán)境，其作為反芻動物胃中的一種消化酶分解微生物，釋放營養(yǎng)物質(zhì)，最后被宿主胃壁吸收。

水牛是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的家養(yǎng)動物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演重要角色，具有役用性能好、乳質(zhì)佳、耐粗飼，且飼料轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)[9]。胃型LYZ c在反芻動物飼料的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的作用，但有關(guān)水牛胃型LYZc基因的研究較少。本研究以河流型和沼澤型水牛為研究對象，對兩類水牛胃型LYZc基因編碼區(qū)序列進(jìn)行了變異檢測和群體遺傳學(xué)分析，并結(jié)合已發(fā)表的?？莆锓N的同源序列進(jìn)行了比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析，以揭示水牛胃型LYZc基因的遺傳特征及其與其他牛科物種的差異。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究總樣本量為224份，其中檳榔江水牛(河流型)66份，沼澤型水牛158份(包括德昌水牛65份，德宏水牛11份，鹽津水牛29份，東流水牛9份，福安水牛17份，湖南濱湖水牛15份和江西濱湖水牛12份)。樣品均為耳組織樣，個體間不存在直接血緣關(guān)系，樣品保存于酒精中低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA提取

采用酚/氯仿法提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其純度和濃度，TE緩沖液稀釋為50 ng/μL，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)水牛胃型LYZc基因全序列(GenBank登錄號為NW_005785126)使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，分別擴(kuò)增該基因的4個外顯子及其旁側(cè)序列。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含ddH2O 19.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，dNTP 0.2 μL(2.5 mmol/L)，Taq酶(5 U/μL)0.3 μL，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min→35個循環(huán)(94 ℃變性30 s→退火40 s→72 ℃延伸30 s)→72 ℃后延伸5 min終止反應(yīng)。退火溫度與延伸時間依引物而異(表1)。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，進(jìn)行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

表1 胃型LYZ c基因分段擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primer information for segmented amplification of stomach LYZ c gene

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 核苷酸序列及變異分析 采用上述引物分別對胃型LYZc基因4個外顯子及旁側(cè)序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，測序結(jié)果采用DNAstar軟件包(DNAstar Inc.)中SeqMan 程序進(jìn)行序列核對和組裝，得到胃型LYZc基因完整外顯子拼接序列，拼接好的序列經(jīng)ORF Finder程序(http：//www.ncbi.nlm.gov/gorf/)確定開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，并翻譯成蛋白序列。編碼區(qū)SNP位點(diǎn)的數(shù)量、位置由SeqMan、Mega 7軟件確定和輸出[10]，各SNP位點(diǎn)的群體遺傳組成用PopGen 32軟件(version 1.31)計(jì)算，單倍型劃分用Phase v2.1軟件進(jìn)行。采用PANTHER蛋白分析軟件(http：//www.pantherdb.org/)預(yù)測氨基酸替換對其功能的影響。

1.4.2 蛋白質(zhì)理化特性及結(jié)構(gòu)分析 水牛LYZ c相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)、疏水性、跨膜區(qū)和信號肽采用在線軟件Compute pI/Mw tool、ProtParam tool、ProtScale、TMHMM server 2.0和SignalP 4.1 Server進(jìn)行預(yù)測分析；采用ProtComp 9.0程序進(jìn)行LYZ c蛋白的亞細(xì)胞定位；通過NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；基于同源建模法利用在線服務(wù)器SWISS-MODEL預(yù)測LYZ c蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外顯子序列拼接及群體變異分析

采用PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)對胃型LYZc的4個外顯子及其旁側(cè)序列進(jìn)行測序，共得到1 014 bp的序列，由ORF Finder程序中確定其編碼區(qū)序列。將獲得的編碼區(qū)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源比對，確定為水牛胃型LYZc基因序列。

在水牛胃型LYZc基因編碼區(qū)中共發(fā)現(xiàn)6個SNP位點(diǎn)，分別為c.87G>T、c.228G>A、c.396C>T、c.423C>T、c.424G>A和c.438C>G，其中SNP87僅存在于河流型水牛中，其他5個SNP為河流型和沼澤型水牛共享。在河流型水牛中發(fā)現(xiàn)的SNP87位點(diǎn)，G等位基因趨于純合，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。水牛中檢測到的5個共享SNP位點(diǎn)在兩類水牛中均以雜合狀態(tài)存在，等位基因頻率相一致，且均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；這些位點(diǎn)除SNP228外，其他4個SNP均位于第4外顯子中。各SNP位點(diǎn)的群體遺傳分析結(jié)果見表2。

表2 水牛胃型LYZ c基因的群體變異信息Tab.2 The variation information of buffalo stomach LYZ c gene

注：W.野生型等位基因；m.突變型等位基因；P.Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)概率。

Note：W.Wild-type allele；m.Mutant-type allele；Pvalue.The probability of Hardy-weinberg equilibrium.

2.2 單倍型劃分及比較基因組學(xué)分析

基于本研究水牛序列SNP位點(diǎn)信息，采用Phase v2.1軟件進(jìn)行兩類水牛單倍型劃分，劃分出的單倍型及其頻率等信息見表3。為了揭示水牛LYZc基因的遺傳特征，采用水牛LYZc單倍型序列作為查詢序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源搜索，獲得以下?？莆锓N的胃型LYZc基因序列進(jìn)行比較分析：水牛序列1條，為：NM_001290888；普通牛序列10條，分別為：BG937730、BG938401、BG937779、BG938044、CK971540、DY056864、M26241、BG937795、M26244和BG937506；瘤牛序列1條：XM_019960836；牦牛序列1條：XM_005900300；野牛序列1條：XM_010841550；山羊序列1條：KC954667(圖1)。在河流型水牛中共確定5種單倍型，即River buffalo_hap1～hap5，其中River buffalo_hap1～hap4為本研究數(shù)據(jù)確定的單倍型；River buffalo_hap1和River buffalo_hap2的期望頻率高，為河流型水牛群體優(yōu)勢單倍型。在沼澤型水牛群體內(nèi)共確定2種單倍型，即Swamp buffalo_hap1～hap2，均為本研究數(shù)據(jù)確定的單倍型，且它們的期望頻率相同。河流型與沼澤型水牛間未發(fā)現(xiàn)共享單倍型。對已發(fā)表的其他?？莆锓N胃型LYZc數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在普通牛中確定10種單倍型，即Cattle_hap1～hap10；在瘤牛、牦牛、野牛和山羊中均確定1種單倍型，分別為Zebu_hap1、Yak_hap1、Bison_hap1和Goat_hap1。

表3 由本研究數(shù)據(jù)確定的水牛LYZ c基因各單倍型信息Tab.3 The haplotypes information of buffalo LYZ c based on the data in this study

各物種LYZ c核苷酸、氨基酸序列比對結(jié)果見圖1，2。各?？莆锓N胃型LYZc基因序列長度相同，均為444 bp，編碼147個氨基酸。將本研究數(shù)據(jù)與已發(fā)表的序列數(shù)據(jù)合并后，水牛的SNP位點(diǎn)數(shù)增加了3個，分別為c.196G>A、c.336G>C和c.351T>C。新增加的SNP位點(diǎn)均只存在于河流型水牛中，因此，共有4個SNP位點(diǎn)只存在于河流型水牛中(SNP87、SNP196、SNP336和SNP351)。水牛中異義替換為2個，分別為p.G66S和p.V142I，對應(yīng)的SNP位點(diǎn)為SNP196和SNP424(圖2)。經(jīng)采用PANTHER軟件預(yù)測表明，水牛中發(fā)現(xiàn)的p.G66S和p.V142I替換對胃型LYZ c功能沒有影響。水牛與其他牛科物種的種間核苷酸差異位點(diǎn)為c.42、c.132和c.348，但只有c.348相應(yīng)的編碼氨基酸與其他牛科物種的不同(水牛：p.116Q；其他牛科物種：p.116H)。序列比對還揭示普通牛和瘤牛特有的核苷酸為c.13G和c.270T(圖1，2)。

由水牛胃型LYZc基因7種單倍型確定出3種蛋白變異體，即Buffalo 1～Buffalo 3。變異體Buffalo 1對應(yīng)水牛LYZc基因River buffalo_hap1、River buffalo_hap3、River buffalo_hap4、Swamp buffalo_hap2單倍型；而變異體Buffalo 2則對應(yīng)River buffalo_hap2、Swamp buffalo_hap1單倍型、變異體Buffalo 3則對應(yīng)River buffalo_hap5單倍型。變異體Buffalo 1在水牛群體中出現(xiàn)頻率最高。由普通牛、瘤牛、牦牛、野牛和山羊LYZc基因單倍型分別各確定了4，1，1，1和1種變異體。水牛群體中發(fā)現(xiàn)有特異的氨基酸替換p.V142I。所有物種在第66位均出現(xiàn)Ser殘基。普通牛和瘤牛具有特異的氨基酸p.5V。各牛科物種間胃型LYZc核苷酸序列差異位點(diǎn)較多，但其編碼蛋白氨基酸序列差異較小(圖1，2)。

圖1 ?？莆锓N胃型LYZ c基因單倍型序列核酸差異Fig.1 Nucleotide differences of haplotypes detected in stomach LYZ c among Bovidae species

圖2 牛科物種胃型LYZ c變異體氨基酸差異Fig.2 Amino acid sequence differences among the variants of stomach LYZ c in Bovidae

2.3 水牛LYZ c變異體序列結(jié)構(gòu)分析

水牛群體中的3種胃型LYZ c蛋白變異體的序列比較見圖3。水牛胃型LYZ c 3種變異體均具有N端的信號肽，切割位點(diǎn)位于第18和第19氨基酸殘基，其成熟肽包含129個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，水牛3種胃型LYZ c變異體都含有1個屬于類溶菌酶超家族的LYZ1保守結(jié)構(gòu)域，位于第19-145氨基酸殘基處，它們均不具有跨膜結(jié)構(gòu)，為分泌到胞外發(fā)揮功能的親水蛋白。通過靶模板比對，構(gòu)建水牛胃型LYZ c三維結(jié)構(gòu)同源模型(圖4)。結(jié)果表明，水牛胃型3種LYZ c變異體成熟肽與普通牛胃型Lysozyme C-2成熟肽氨基酸序列長度相同，一致性分別為98.45%，97.67%和98.45%。

陰影表示信號肽序列；下劃線表示保守結(jié)構(gòu)域。Signal peptide sequence is highlighted as shaded region；The region underlined indicates the putative conserved domain.

2.4 LYZ c蛋白序列差異分析

將水牛胃型LYZ c變異體氨基酸序列與已報道的普通牛胃型(S1、S2和S3)和非胃型(牛奶、腎、氣管和小腸)LYZ c氨基酸序列(Ensembl database ID：ENSBTAG00000011941、ENSBTAG00000026779、ENSBTAG00000000198、ENSBTAG00000026323、ENSBTAG00000046511、ENSBTAG00000026088和ENSBTAG00000046628)進(jìn)行比較[8]，結(jié)果見圖5。水牛胃型LYZ c變異體與普通牛3種胃型LYZ c氨基酸序列一致性較高，與非胃型LYZ c序列差異較大。水牛與普通牛胃型LYZ c在氨基酸序列上的差異主要體現(xiàn)在第116，144位氨基酸的組成上，這2個位點(diǎn)對LYZ c蛋白的等電點(diǎn)影響較大。水牛3種LYZ c變異體第116，144位氨基酸與普通牛S1蛋白一致，分別為Gln(PI=5.65)和Glu(PI=3.22)，而普通牛S2蛋白在這2個位點(diǎn)分別為His和Glu，普通牛S3則分別為His(PI=7.59)和Gln。相比于普通牛非胃型LYZ c氨基酸序列，水牛與普通牛胃型LYZ c蛋白一樣，缺失了非胃型LYZ c蛋白第120-121位氨基酸之間的Asp-Pro肽鍵。

圖4 水牛胃型LYZ c變異體三級結(jié)構(gòu)Fig.4 The tertiary structure of buffalo stomach LYZ c protein

水牛胃型與普通牛的胃型、非胃型LYZ c蛋白理化特性的比較見表4。胃型LYZ c蛋白的等電點(diǎn)較低，偏向于酸性，而非胃型LYZ c蛋白偏向于堿性。胃型LYZ c蛋白含有的正電荷和負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)基本相同，而非胃型LYZ c蛋白含有正電荷的氨基酸殘基數(shù)普遍大于負(fù)電荷的氨基酸殘基。水牛和普通牛胃型LYZ c蛋白的理化特性差異較小，但水牛胃型LYZ c蛋白的等電點(diǎn)更低。所有LYZ c蛋白變異體均屬于穩(wěn)定的親水蛋白。

圖5 LYZ c氨基酸序列比對Fig.5 Alignment of LYZ c amino acid sequences

基本理化特征Physicochemicalproperty胃型Stomach非胃型NonstomachB1B2B3S1S2S3牛奶Milk腎Kidney氣管Trachea小腸Intestinal氨基酸數(shù)147147147147147147148148147147Numberofaminoacids等電點(diǎn)(PI)6.806.806.806.806.877.559.928.149.419.65Isoelectricpoint分子量/kDa16.2816.2916.3216.2816.3016.3216.7816.4815.8816.39Molecularweight負(fù)電荷殘基151515151514101189(Asp+Glu)正電荷殘基15151515151526131923(Arg+Lys)不穩(wěn)定系數(shù)24.6727.6630.2824.6728.6728.6722.8235.2415.3118.76Instabilityindex(II)平均疏水性-0.110-0.108-0.111-0.110-0.113-0.111-0.322-0.108-0.071-0.228GRAVY脂肪系數(shù)82.9383.6183.6182.9382.2482.9388.3183.1187.6281.56Aliphaticindex

注：B1～B3.水牛胃型LYZ c變異體；S1～S3.普通牛胃型LYZ c蛋白。

Note：B1-B3.Buffalo stomach LYZ c variants；S1-S3.Cattle stomach LYZ c proteins.

3 討論與結(jié)論

本研究通過分段測序，獲得了水牛胃型LYZc基因的編碼區(qū)序列。水牛胃型LYZc基因編碼區(qū)長為444 bp，編碼蛋白具有一個18肽的N端信號肽，成熟肽包含129個氨基酸。在水牛胃型LYZc基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)9個SNP位點(diǎn)，有4個存在于外顯子4中。河流型與沼澤型水牛共享5個SNP位點(diǎn)，共享的SNP位點(diǎn)具有相同的群體遺傳特征。分析表明，有2個SNP位點(diǎn)導(dǎo)致了氨基酸的替換，但它們對LYZ c蛋白的功能沒有影響。本研究確定胃型LYZc基因的c.42、c.132和c.348位核苷酸為水牛與其他?？莆锓N相互區(qū)分的核苷酸位點(diǎn)，在蛋白水平上只有第348位相應(yīng)的編碼氨基酸與其他牛科物種不同，這些核苷酸位點(diǎn)可以作為水牛與其他物種間親緣分析的分子標(biāo)記。在水牛中確定胃型LYZ c蛋白存在3種變異體，河流型水牛存在變異體Buffalo 1～3，沼澤型水牛中只有變異體Buffalo 1～2。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，水牛中的3種LYZ c蛋白變異體在氨基酸組成上只有1～2處差異，它們在理化特性、結(jié)構(gòu)上的特征基本一致，揭示它們間的功能差異較小，也提示兩類水牛間LYZ c的功能差異較小。牛科物種胃型LYZc基因編碼區(qū)序列比對發(fā)現(xiàn)，雖然該區(qū)域SNP位點(diǎn)較多，但異義替換較少，LYZ c氨基酸序列一致性較高，其中普通牛和瘤牛一致性更高，這揭示牛科物種胃型LYZc基因具有較高的功能保守性。

哺乳動物典型的溶菌酶c是在中性pH環(huán)境下發(fā)揮功能，而反芻動物胃型溶菌酶c裂解胃中細(xì)菌的細(xì)胞壁，其發(fā)揮功能必須要適應(yīng)酸性pH環(huán)境，并對胃中的消化酶具有抗性[3]。在這種適應(yīng)的過程中，反芻動物胃型LYZ c的氨基酸序列發(fā)生了一些適應(yīng)性改變。這些改變包括賴氨酸被精氨酸殘基替換，從而消除了胃中消化酶潛在的裂解位點(diǎn)，同時還失去了天冬氨酸-脯氨酸間的酸不穩(wěn)定肽鍵[11-12]。胃型LYZ c的天冬氨酸殘基與酰胺基的含量與非胃型LYZ c相比偏低，同時它所含有的酸不穩(wěn)定氨基酸殘基(天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)數(shù)量僅有18個，而非胃型LYZ c含有20～28個，這些特征保證了胃型LYZ c能在低pH環(huán)境下維持其功能。本研究預(yù)測水牛胃型LYZ c蛋白具有LYZ 1保守結(jié)構(gòu)域，揭示它具有裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，消化微生物細(xì)胞壁的功能。水牛胃型LYZ c與牛奶和腎溶菌酶相比，其第120位的Asp被Glu替換，同時還缺失了121位的Pro，這樣就失去了非胃型LYZ c蛋白原有的天冬氨酸-脯氨酸二肽，提高了水牛胃型LYZ c對酸性環(huán)境的耐受力[13]。水牛除了具有普通牛胃型LYZ c蛋白的特點(diǎn)外(酸不穩(wěn)定氨基酸殘基數(shù)為18個、不具有天冬氨酸-脯氨酸二肽)，水牛胃型LYZ c蛋白的第116位氨基酸為Gln，其等電點(diǎn)為5.65，而普通牛Stomach 3在該位點(diǎn)上為His，等電點(diǎn)為7.59；同時，水牛第144位氨基酸為Glu，等電點(diǎn)為3.22，普通牛Stomach 3在該位點(diǎn)上為Gln。因此，水牛胃型LYZ c蛋白的等電點(diǎn)(pI=6.80)比普通牛Stomach 3蛋白(pI=7.55)的更低，這可能會導(dǎo)致水牛胃型LYZ c蛋白更適合酸性環(huán)境。

許多研究表明，在相同的飼喂條件下，水牛粗纖維消化率要高于其他反芻動物[14-17]。水牛對粗飼料的高消化率，可能是由于水牛瘤胃內(nèi)特殊的微生物生態(tài)系統(tǒng)造成的[18]。其可能具有更多的纖維素分解菌、真菌游動孢子以及較低的原蟲數(shù)量，導(dǎo)致水牛瘤胃微生物具有更高的蛋白質(zhì)合成能力和氮循環(huán)利用能力[19-20]。水牛與普通牛胃型LYZ c蛋白之間最主要的差異是等電點(diǎn)不同，造成這種差異的原因可能與水牛瘤胃內(nèi)特殊的微生物生態(tài)系統(tǒng)有關(guān)，推測胃型LYZ c與其瘤胃內(nèi)的微生物經(jīng)歷了長期協(xié)同進(jìn)化的過程。

本研究在水牛胃型LYZ c內(nèi)共發(fā)現(xiàn)9個SNP位點(diǎn)，定義了7種單倍型，確定了3種變異體，但它們的功能差異較小。河流型與沼澤型水牛在核苷酸水平盡管存在一定差異，但兩者的胃型LYZ c蛋白功能一致。水牛胃型LYZ c變異體不僅可以適應(yīng)胃中的酸性環(huán)境，也可以在胃中裂解微生物細(xì)胞壁，這與其他?？莆锓N的胃型LYZ c蛋白具有相似性，但水牛胃型LYZ c蛋白等電點(diǎn)比普通牛更低，表明水牛胃型LYZ c蛋白更適應(yīng)胃中酸性環(huán)境。水牛與牛科物種的胃型LYZ c蛋白氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和功能相近，揭示該基因在牛科物種中是由共同的祖先基因進(jìn)化而來的，且受到了較高的選擇壓力。

[1] Chauss M，Hume I D，Hummel J.Evolutionary adaptations of ruminants and their potential relevance for modern production systems[J].Animal，2010，4(7)：979-992.

[2] Steven C E，Hume L D.Contributions of microbes in vertebrate gastrointestinal tract to production and conservation of nutrients[J].Physiological Reviews，1998，78(2)：393-427.

[3] Callewaert L，Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom[J].Journal of Biosciences，2010，35(1)：127-160.

[4] Jollès P，Jollès J.What′s new in lysozyme research?Always a model system，today as yesterday[J].Molecular and Cellular Biochemistry，1984，63(2)：165-189.

[5] Priyadarshini S，Kansal V K.Lysozyme activity in Buffalo milk：Effect of lactation period，parity，mastitis，season in India，pH and milk processing heat treatment[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2002，15(6)：895-899.

[6] 江偉華，朱蓮蓮，劉益麗，等.藏綿羊溶菌酶1基因的克隆，原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(1)：44-52.

[7] 劉 梅，張士璀.溶菌酶C及其生物學(xué)功能[J].生命的化學(xué)，2006，26(5)：465-467.

[8] Irwin D M.Genomic organization and evolution of ruminant lysozyme c genes[J].Zoological Research，2015，36(1)：1-17.

[9] 余 梅，劉建勇，趙 剛，等.補(bǔ)飼精料對采食蔗梢青貯水牛消化代謝的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，28(4)：470-475.

[10] Kumar S，Stecher G，Tamura K.MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Molecular Biology and Evolution，2016，33(7)：1870-1874.

[11] Stewart C B，Schilling J W，Wilson A C.Adaptive evolution in the stomach lysozymes of foregut fermenters[J].Nature，1987，330(6146)：401-404.

[12] 鄧霄禹，胡明軍，江明鋒.反芻動物胃溶菌酶的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(9)：143-147.

[13] Irwin D M.Evolution of cow nonstomach lysozyme genes[J].Genome，2004，47(6)：1082-1090.

[14] Chanthakhoun V，Wanapat M，Kongmun P，et al.Comparison of ruminal fermentation characteristics and microbial population in swamp Buffalo and cattle[J].Livestock Science，2012，143(2/3)：172-176.

[15] Hussain I，Cheeke P R.Evaluation of annual ryegrass straw：corn juice silage with cattle and water Buffalo：digestibility in cattle vs.Buffalo，and growth performance and subsequent lactational performance of Holstein heifers[J].Animal Feed Science and Technology，1996，57(3)：195-202.

[16] Jabbari S，Eslami M，Chaji M，et al.The comparison ofinvitrodigestibility of wheat straw by rumen microorganism of Khuzestani buffalo and Hostein cow[J].International Conference on Biology，2010，1：266-268.

[17] 張 勤，李麗莉，韋升菊，等.尼龍袋法比較水牛與娟姍牛對象草消化能力的差異[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2016，42(2)：20-24.

[18] 張瑞云，錢朝海，顧招兵，等.反芻動物飼料營養(yǎng)價值評定方法及在水牛中的應(yīng)用[J].中國奶牛，2016，313(5)：4-9.

[19] Wanapat M.Rumen manipulation to increase the efficient use of local feed resources and productivity of ruminants in the tropics[J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences，2000，13：59-67.

[20] 梁停停，劉文麗，許 浩，等.水牛瘤胃微生物研究進(jìn)展[J].中國奶牛，2017，322(2)：1-5.