張 凱，高 珊，朱樹(shù)華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

糖為植物生長(zhǎng)和呼吸提供能量，是所有植物生存的基礎(chǔ)物質(zhì)[1]，也是決定果實(shí)品質(zhì)的重要因素。在大多數(shù)高等植物中，通過(guò)光合作用產(chǎn)生的碳水化合物以蔗糖為主，通過(guò)韌皮部分配運(yùn)輸?shù)讲煌膸?kù)組織中。在植物組織中，蔗糖可以被直接貯藏，還可以在蔗糖合成酶或者轉(zhuǎn)化酶的作用下轉(zhuǎn)化成己糖[2]，也就是葡萄糖和果糖。在植物呼吸代謝過(guò)程中，己糖經(jīng)過(guò)己糖激酶(Hexokinase，HK)磷酸化開(kāi)始進(jìn)行糖酵解，從而為植物活動(dòng)提供能量和代謝產(chǎn)物[3-5]，因此植物中淀粉的合成和碳元素的循環(huán)離不開(kāi)HK對(duì)己糖的磷酸化[6-7]。HK也被稱(chēng)為雙功能兼職酶[8]，在植物的生長(zhǎng)進(jìn)程中，HK不僅參與糖代謝，而且是己糖傳感器[9]，在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起到傳感和信號(hào)作用，能夠感知外界營(yíng)養(yǎng)、光和激素信號(hào)，調(diào)控植物的生長(zhǎng)[10]。

廣義上，植物中的HK包含己糖激酶、果糖激酶和葡萄糖激酶。果糖激酶對(duì)果糖有高度的特異性，葡萄糖激酶對(duì)葡萄糖具有專(zhuān)一性，而HK可以磷酸化果糖、葡萄糖等一系列己糖[11]。目前已經(jīng)證實(shí)幾乎所有生物體中都存在HK，根據(jù)對(duì)番茄、馬鈴薯等植物的HK研究發(fā)現(xiàn)HK存在同工酶，并且多數(shù)植物中都存在1～3個(gè)同工酶[12-13]。有研究表明，線(xiàn)粒體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑匯聚于線(xiàn)粒體HKⅡ上[14]，HKⅡ可以與線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)化孔(MPTP)上的電壓依賴(lài)型陰離子通道(VDAC)發(fā)生相互作用，HKⅡ從VDAC上脫落誘導(dǎo)VDAC蛋白關(guān)閉進(jìn)而抑制MPTP的開(kāi)放，從而調(diào)控線(xiàn)粒體的通透性[15-16]。

本試驗(yàn)以肥城桃(Prunuspersica(L.)Batsch cv.Feicheng)為試驗(yàn)材料，克隆得到肥城桃果實(shí)HKⅡ基因全長(zhǎng)并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并在大腸桿菌中成功表達(dá)并且純化出HKⅡ蛋白，以期對(duì)植物HKⅡ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有進(jìn)一步的了解，從而為揭示HKⅡ在線(xiàn)粒體中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試驗(yàn)材料

以肥城桃果實(shí)為試驗(yàn)材料，于2015年采摘自山東省肥城市肥城桃基地。選擇顏色均勻、大小相似、無(wú)機(jī)械損傷和無(wú)病蟲(chóng)害的七成熟桃果實(shí)，采摘后于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，0 ℃環(huán)境中預(yù)冷24 h后將果實(shí)切成大小均勻的碎塊用液氮冷凍處理，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌菌種E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒采購(gòu)于全式金公司?？寺≥d體pMD18-T Vector采購(gòu)于寶生物公司。本研究所用引物(表1)均由華大基因公司合成。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers and sequences

注：GGTACC為KpnⅠ酶切位點(diǎn)；GGATCC為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

Note: GGTACC isKpnⅠrestriction site；GGATCC isBamHⅠrestriction site.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取肥城桃果實(shí)總RNA及合成1st-Strand cDNA 總RNA參考改良CTAB法提取[17]，使用購(gòu)自TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成1st-Strand cDNA。

1.2.2HKⅡ基因中間片段序列的克隆 根據(jù)從GenBank中查找的碧桃的HKⅡ基因片段，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)HKⅡ-F和HKⅡ-R作為驗(yàn)證引物，以合成的1st-Strand cDNA為模板加入PCR反應(yīng)體系，將反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的條帶的凝膠塊切塊回收，使用Gel Extraction Kit(康為世紀(jì))回收DNA片段。將目的DNA連接pMD18-T載體，通過(guò)熱激法將構(gòu)建好的克隆載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5α中。通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆后送至測(cè)序公司(北京華大基因)。

1.2.3HKⅡ基因全長(zhǎng)的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的HKⅡ基因片段，設(shè)計(jì)RACE引物HKⅡ-S、HKⅡ-AS和巢式引物HKⅡ-NS、HKⅡ-NAS。使用SMARTTMRACE cDNA(TaKaRa)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE。將RACE得到的PCR產(chǎn)物作為PCR中的復(fù)制模板，加入巢式引物HKⅡ-NS、HKⅡ-NAS進(jìn)行巢式PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳純化后，切膠回收目的DNA，送至華大公司測(cè)序。將測(cè)序得到的5′端和3′端核苷酸序列與中間片段拼接，得到HKⅡ基因全長(zhǎng)。將獲得的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast檢索分析同源序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行HKⅡ氨基酸序列同源性分析，使用MEGA 4.1軟件構(gòu)建HKⅡ蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用ProtParam tool在線(xiàn)分析HKⅡ蛋白的理化性質(zhì)和親水性。使用PSIPRED分析HKⅡ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL對(duì)HKⅡ蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的模擬。

1.2.4 體外重組HKⅡ蛋白 根據(jù)HKⅡ的核苷酸完整開(kāi)放閱讀框，使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)帶有不同酶切位點(diǎn)的引物HKⅡ-1和HKⅡ-2。RT-PCR獲得HKⅡ的DNA全長(zhǎng)與pMD18-T Vector連接，構(gòu)建克隆載體。將克隆載體和pET-30a質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后，采用T4DNA Ligase連接目的片段，獲得pET-30a-HKⅡ重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET-30a-HKⅡ?qū)氡磉_(dá)菌株BL21，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行體外重組蛋白。取200 μL菌液加入到10 mL含抗生素的培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌至OD600=0.4～0.6，取1 mL菌液用于電泳檢測(cè)，向剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，38 ℃條件下誘導(dǎo)8 h，取1 mL菌液進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 HKⅡ重組蛋白的純化 采用帶有His標(biāo)簽的Ni-瓊脂糖凝膠(Solarbio)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化，按照說(shuō)明書(shū)的使用方法操作。洗脫蛋白的咪唑洗脫液效果最佳濃度為200 mmol/L。用12%的SDS-PAGE分析純化后的HKⅡ蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 HKⅡ基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

通過(guò)GenBank中桃果實(shí)的HKⅡ基因片段，設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物HKⅡ-F和HKⅡ-R，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得結(jié)果如圖1-A所示，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后序列一致。根據(jù)中間片段序列設(shè)計(jì)RACE引物以及巢式引物，進(jìn)行RACE擴(kuò)增和巢式PCR后得到與預(yù)期長(zhǎng)度一致的目的條帶，得到如圖1-B所示的結(jié)果，將5′與3′-RACE的核苷酸序列與中間片段進(jìn)行拼接后獲得肥城桃HKⅡ基因cDNA全長(zhǎng)序列，共1 835 bp。

A.HKⅡ基因中間片段：1.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.PCR產(chǎn)物。B.巢式PCR：1.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3.3′巢式PCR產(chǎn)物；4.5′巢式PCR產(chǎn)物。A.Middle sequences of HKⅡ gene：1.DL2000 Marker；2.Product of PCR.B.Nested PCR：1.DL2000 Marker；2，3.Nested PCR of 3′-RACE products；4.Nested PCR of 5′-RACE products.

2.2 HKⅡ基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)HKⅡ基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析(圖2-A)，該序列具有起始密碼子ATG(173 bp)和終止密碼子TGA(1 664 bp)，存在完整的開(kāi)放閱讀框。閱讀框共有1 496個(gè)堿基，編碼497個(gè)氨基酸(圖2-B)。PortParam tool預(yù)測(cè)蛋白分子式為C2379H3846N652O717S17，原子總數(shù)為7 611個(gè)，分子量為53.6 kDa，理論等電點(diǎn)為6.17，總平均疏水指數(shù)為0.023，表明HKⅡ蛋白為疏水性蛋白。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)HKⅡ?yàn)榭缒さ鞍?，?次跨膜，絕大部分在膜外。如圖3-A所示，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HKⅡ蛋白由15段α螺旋和11段β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。肥城桃HKⅡ蛋白預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3-B所示，其蛋白結(jié)構(gòu)呈V字型，折疊結(jié)構(gòu)較多。

2.3 HKⅡ氨基酸序列同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

試驗(yàn)獲取的桃果實(shí)HKⅡ氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast，與其他植物HKⅡ氨基酸序列比對(duì)，得到如圖4所示的同源性關(guān)系。比對(duì)顯示，桃果實(shí)與其他植物的HKⅡ氨基酸的同源性較高，其中與獼猴桃(Actinidiadeliciosa)、橙子(Citrussinensis)、木豆(Cajanuscajan)、枇杷(Eriobotryajaponica)、蘋(píng)果(Malusdomestica)、葡萄(Vitisvinifera)、桑樹(shù)(Morusnotabilis)、香瓜(Cucumismelo)、煙草(Nicotianatabacum)的相似度分別是91.58%，91.98%，92.18%，96.98%，96.58%，89.13%，93.59%，92.18%，90.78%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)中碧桃和枇杷在一支上，與同源比對(duì)結(jié)果一致。結(jié)果符合進(jìn)化關(guān)系，說(shuō)明植物的HKⅡ蛋白具有較高的保守性。

圖2 HKⅡ基因cDNA序列(A)和氨基酸序列(B)Fig.2 Full length sequence of cDNA (A) and amino acid sequence (B) of HKⅡ

2.4 HKⅡ的體外表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-30a-HKⅡ?qū)氪竽c桿菌BL21(DE3)中，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得HKⅡ重組蛋白。電泳結(jié)果如圖6-A所示，HKⅡ重組蛋白表達(dá)成功。菌液通過(guò)超聲破碎分離出包涵體，溶解于6 mol/L鹽酸胍緩沖液中，經(jīng)過(guò)Ni-瓊脂糖凝膠純化后，獲得較高純度的HKⅡ重組蛋白(圖6-B)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)NCBI中碧桃HKⅡ的cDNA序列為模板設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，以肥城桃果實(shí)中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR，測(cè)序后試驗(yàn)結(jié)果與碧桃的序列片段一致，根據(jù)該片段設(shè)計(jì)RACE引物和巢式PCR引物，獲得HKⅡ基因5′和3′端序列后，片段拼接得到共計(jì)1 664 bp的肥城桃果實(shí)HKⅡ基因cDNA序列，編碼氨基酸497個(gè)。對(duì)HKⅡ進(jìn)行序列比對(duì)和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)桃HKⅡ具有較高的同源性，與枇杷(ADZ96378.1)的HK同源性最高。本試驗(yàn)還體外表達(dá)了HKⅡ蛋白，通過(guò)Ni-瓊脂糖凝膠純化出帶有His標(biāo)簽的目的蛋白。

人們?cè)?956年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了己糖激酶，在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)植物體組織中存在好幾種不同的己糖激酶，它們分布在細(xì)胞的葉綠體、線(xiàn)粒體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等不同的組織中，而且它們的層析和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有一定差異[18]。細(xì)胞質(zhì)中的HK可活化其中的葡萄糖[19]，而線(xiàn)粒體膜上的HK參與糖酵解過(guò)程[20]，細(xì)胞核中HK可以影響調(diào)控葡萄糖信號(hào)基因的表達(dá)。有研究表明，蘋(píng)果的HK在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中含量最高，為39.1%，其次是線(xiàn)粒體，為17.4%[21]，本研究為下一步桃果實(shí)中HKⅡ基因的亞細(xì)胞定位和探討打下了基礎(chǔ)。

圖3 HKⅡ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(B)Fig.3 The second structure (A) and thepredicted tertiary structure (B) of HKⅡ protein

由上而下依次為橙子、獼猴桃、木豆、枇杷、蘋(píng)果、葡萄、桑樹(shù)、香瓜、煙草、碧桃。The amino acid sequence in the map which from the top to the bottom represent are：Citrus sinensis，Actinidia deliciosa，Cajanus cajan，Eriobotrya japonica，Malus domestica，Vitis vinifera，Morus notabilis，Cucumis melo，Nicotiana tabacum，Prunus persica.

分支上的數(shù)值表示1 000次重復(fù)計(jì)算得到的Bootstrap值。The values on the branches represent the Bootstrap values obtained by the 1 000 iteration.

A.HKⅡ重組蛋白表達(dá)：1.低分子蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，4.含pET-30a-HKⅡ質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白；3.含pET-30a-HKⅡ質(zhì)粒，未誘導(dǎo)的蛋白；5.含pET-30a的質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白。B.HKⅡ重組蛋白純化：1.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白；2.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白；3.低分子蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；4～6.純化后的HKⅡ蛋白。

A．Recombinant protein expression of HKⅡ：1.Standard protein molecular mass Markers；2，4.pET-30a-HKⅡ with induction by IPTG；3.pET-30a-HKⅡ without induction；5.pET-30a with induction by IPTG.B.Purification of HKⅡ recombinant protein：1.pET-30a-HKⅡ with induction by IPTG；2.pET-30a-HKⅡ without induction；3.Standard protein molecular mass Markers；4-6.Purified HKⅡ protein.

圖6HKⅡ重組蛋白12%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳
Fig.6RecombinantHKⅡproteinin12%SDS-PAGE

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，己糖激酶參與高等植物的糖感受和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，植物細(xì)胞能夠響應(yīng)和感受己糖激酶信號(hào)，己糖激酶還參與了植物細(xì)胞程序性死亡。VDAC作為調(diào)控線(xiàn)粒體膜通透性和參與細(xì)胞凋亡通路的重要組成部分[22]，和HK結(jié)合后影響了MPTP的開(kāi)放。另有研究表明，在植物中VDAC和HK的表達(dá)量是一致的[23-24]。這表明，在植物體中HK參與糖酵解和細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，更多關(guān)于肥城桃果實(shí)HKⅡ的重組蛋白活性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)分析的試驗(yàn)正在進(jìn)行中，將為HK參與的多種信號(hào)通路和糖感受機(jī)制提供理論依據(jù)。

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