蔡 曼，李衛(wèi)華，柳延濤，余 渝，孔憲輝，王 娟，王旭文，劉 麗

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家棉花改良中心新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)分中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)，新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 作物研究所，新疆 石河子 832000)

棉花是我國重要的纖維作物及經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位。新疆棉區(qū)是我國最大的棉花產(chǎn)區(qū)，但是由于新疆地區(qū)地理位置特殊，春季氣候多變，無霜期短，生長早期常有倒春寒，后期常有早霜等低溫冷害天氣。低溫不僅會(huì)降低棉花的產(chǎn)量，也會(huì)使棉花的品質(zhì)變差，從而直接影響棉花種植的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究棉花的抗寒機(jī)理，培育具有耐寒性的優(yōu)質(zhì)棉花具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

Lyons的“膜脂相變” 學(xué)說[1]認(rèn)為植物膜脂不飽和脂肪酸含量升高，膜脂相變溫度會(huì)相應(yīng)降低，從而增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使植物的抗寒性有所提高。Levitt[2]、Palta等[3]以及Orvar等[4]研究指出，低溫對植物的傷害首先發(fā)生在植物細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物抗寒性密切相關(guān)，其穩(wěn)定性對植物抵抗低溫脅迫具有重要的意義。而在低溫情況下，細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層的不飽和性決定了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。因此，細(xì)胞膜膜質(zhì)的不飽和性對植物的抗寒性有著重大影響[5]。我國許多學(xué)者都做了不飽和脂肪酸含量與植物抗寒性關(guān)系的研究[6-10]。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，挖掘出了很多與脂肪酸含量相關(guān)的基因[11]，學(xué)者們通過改變目的基因的表達(dá)來提高不飽和脂肪酸的含量，從而達(dá)到提高植物抗寒性的目的[12-15]。Δ9-硬脂酰-ACP 脫氫酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是不飽和脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶[16]，直接決定植物油脂中的不飽和脂肪酸的總量，以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例[17-18]，對細(xì)胞膜在低溫環(huán)境下的穩(wěn)定性起重要的作用[19]。因此，可以通過SAD基因的超量表達(dá)或反義表達(dá)等途徑來調(diào)控飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的合成定向改變植物種質(zhì)，以調(diào)節(jié)植物體中脂肪酸的成分和含量，從而改善植物的抗寒性。研究表明，膜脂中不飽和脂肪酸的比例及含量與植物的抗寒性有著相當(dāng)密切的關(guān)系[20-24]。Cheesbrough[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，長在 20 ℃大豆的SAD基因活性比生長在 35 ℃大豆的SAD基因活性高5倍。Vega等[27]研究發(fā)現(xiàn)，低溫4 ℃下，馬鈴薯SAD基因轉(zhuǎn)錄水平比對照組(20 ℃)顯著升高，說明SAD基因的表達(dá)與馬鈴薯的低溫適應(yīng)性有一定關(guān)系。Polashock和Ma等[28-29]分別將酵母的SAD基因和菠菜的SAD基因?qū)霟煵?，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性都有不同程度增強(qiáng)。Los[30]分別將正向和反向SAD基因插入植物雙元表達(dá)載體pBI121中，通過基因工程轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)正向表達(dá)SAD基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性明顯增強(qiáng)，反之轉(zhuǎn)反向表達(dá)SAD基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性明顯減弱。銀杏的GbSAD基因在4，15 ℃處理下該基因的水平穩(wěn)步上升[31]。陸地棉GhSAD2基因在不同程度低溫處理下均有上調(diào)表達(dá)[32]。Liu等[33]在GenBank中注冊了陸地棉SAD基因的全長 cDNA 序列(X95988.1)，但關(guān)于棉花SAD基因在抗寒性相關(guān)方面的研究未見報(bào)道。

本研究克隆陸地棉GhSAD2基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-GhSAD2，并將該表達(dá)載體通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過測定轉(zhuǎn)基因陽性煙草的電解質(zhì)滲透率及其表型性狀來探究GhSAD2基因在抗寒方面的作用，以期為提高棉花抗寒性提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 新陸早33號種子和煙草種子由新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花所提供。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購于北京全式金生物有限公司；克隆載體pMD19-T購于日本TaKaRa公司；根癌農(nóng)桿菌GV3101、表達(dá)載體pBI121由新疆石河子大學(xué)綠洲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試驗(yàn)所用的試劑 一些工具酶、T4連接酶、Pfu高保真酶、用于標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)的DNA分子量、PCR所用的TaqDNA 聚合酶等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)中所用到的用來回收目的片段的膠回收試劑盒、用于提取菌液中質(zhì)粒的質(zhì)粒試劑盒等購于天根生化科技(北京)有限公司；試驗(yàn)中所用到的用于雙酶切的XbaⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶、PrimerScriptTM RT Reagent Kit購自日本TaKaRa公司；蔗糖、MS購于Sigma公司。

1.1.4 引物合成及測序 試驗(yàn)所有涉及的PCR引物的合成過程以及在克隆時(shí)基因的測序過程，都是由上海生工完成的。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料種植 挑選顆粒飽滿、顏色正常且沒有受損的新陸早33號種子播種在事先準(zhǔn)備好的蛭石和營養(yǎng)土比例為3∶1的花盆中，于28 ℃(16 h/8 h)的光照培養(yǎng)箱中取2～3片真葉的棉花幼苗葉片，提取植物總RNA，用于基因克隆分析。

煙草無菌苗種植：選取籽粒飽滿、顏色正常的健康煙草種子放入1.5 mL的離心管中，用75%乙醇浸泡30 s，30% H2O2浸泡 10 min，浸泡過程中用移液槍反復(fù)吹打，隨后用無菌水沖洗5次，每次1 min，最后將種子用牙簽或1 mL移液槍均勻的點(diǎn)播于MS固體培養(yǎng)基，在 28 ℃(16 h/8 h)下培養(yǎng)5 d后，選取培養(yǎng)基中長勢良好的幼苗接種于1/2MS培養(yǎng)基中，選取生長20 d后的無菌煙草苗作為轉(zhuǎn)化植株。

1.2.2 棉花總RNA的提取和cDNA 的制備 采用CTAB法提取棉花葉片總RNA[34]。

1.2.3 棉花GhSAD2基因的克隆 從GenBank下載GhSAD2基因(KX197920)的序列，獲得了1個(gè)包含GhSAD2全長ORF的基因序列，根據(jù)其開放閱讀框序列設(shè)計(jì)克隆引物，分析GhSAD2基因和pBI121的酶切位點(diǎn)，根據(jù)分析結(jié)果，在每條引物上加入不同的酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建表達(dá)載體。具體引物序列及酶切位點(diǎn)參照表1。

表1 基因擴(kuò)增的引物Tab.1 Primer sequence for gene amplification

注：下劃線所標(biāo)注的堿基是用于表達(dá)載體構(gòu)建在 PCR 擴(kuò)增引物上所引入的限制性酶切位點(diǎn)。

Note：The underscore labeled base is used to express the vector construct on the PCR amplification primer introduced by the restriction site.

采用常規(guī)PCR方法克隆棉花GhSAD2基因序列，以棉花cDNA為模板，以高保真聚合酶Pfu高保真酶(全式金，北京)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×EasyPfu Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，EasyPfu DNA Polymerase 0.4 μL，正向引物和反向引物各加入1 μL；棉花DNA模板1 μL后用ddH2O補(bǔ)充到20 μL。PCR時(shí)所用的反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s，退火65.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收約1 200 bp的目的片段，將其連接到克隆載體pMD19-T上，構(gòu)成重組質(zhì)粒，所用的連接體系為：pMD19-T Vactor 1 μL，Solution I 1 μL，回收的目的片段4 μL。將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，菌液PCR鑒定，將篩選得到的陽性菌液送至上海生工進(jìn)行測序驗(yàn)證。用軟件DNAMAN對測序結(jié)果進(jìn)行比對，選取比對結(jié)果大于98%的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取，并將其命名pMD19-T-GhSAD2。

1.2.4 棉花GhSAD2基因表達(dá)載體的構(gòu)建 用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切pMD19-T-GhSAD2質(zhì)粒和pBI121雙元表達(dá)載體，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并回收大于10 000 bp的目的大片段和1 200 bp左右的目的小片段，從而獲得GhSAD2基因片段和pBI121載體片段。將GhSAD2基因的線性片段和酶切消化的pBI121載體片段分子，按 3∶1摩爾比混合，T4連接酶(全式金，北京)4 ℃連接過夜。用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1中，并將其均勻涂布于含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)基上，放置37 ℃恒溫箱中過夜，從中挑取出單克隆的菌落，用引物GhSAD2F和GhSAD2R進(jìn)行菌落的PCR鑒定，凝膠電泳檢測，跑膠結(jié)果中出現(xiàn)了預(yù)期條帶的菌液為候選的陽性克隆菌液，用質(zhì)粒提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行提質(zhì)粒，將提取到的質(zhì)粒用XbaⅠ、SmaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，最終獲得pBI121-GhSAD2陽性克隆。

1.2.5 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pBI121-GhSAD2電擊轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中，并將其均勻涂布于含有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB平板上，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)約48 h。從中挑取單克隆的菌株將其接種于含50 μg/mL的卡那霉素和含50 μg/mL利福平霉素的2 mL 的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)20 h左右，然后吸取1 mL培養(yǎng)的菌液接種至50 mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫28 ℃振蕩培養(yǎng)，用分光光度計(jì)測其OD值 ，當(dāng)OD值在1.2～1.6時(shí)。常溫，4 000 r/min 離心10 min，用MS轉(zhuǎn)化液重懸沉淀混勻至OD值=0.4～0.6，然后進(jìn)行煙草的轉(zhuǎn)化。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定和GUS活性組織染色 按照CTAB-SDS法提取野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA[35]，并用GhSAD2F和GhSDA2R引物分別對野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對PCR產(chǎn)物電泳檢測，確認(rèn)GhSAD2基因是否已經(jīng)成功導(dǎo)入并整合到轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中。表達(dá)載體pBI121-GhSAD2攜帶GUS報(bào)告基因，用GUS染色試劑盒進(jìn)行染色，以PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草幼嫩的葉片作為試驗(yàn)的材料，其中野生型煙草作為對照組。將需要檢測煙草葉片放于2 mL的離心管中，并用事先配置好的X-Gluc染液將其完全浸沒，置于28 ℃下顯色2 h后，并用75%乙醇進(jìn)行脫色3次，再用無水乙醇脫色1次，直至將對照葉片完全脫色時(shí)，將轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草放置在一起觀測，并對2種類型的葉片進(jìn)行拍照。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性鑒定 選取苗齡2個(gè)月左右的轉(zhuǎn)基因煙草用于煙草抗寒性的鑒定，選取長勢一致的野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草作為本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料，在4 ℃處理48 h后測定其電解質(zhì)滲漏率。測定方法采用Gong等[36]的方法，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhSAD2基因的克隆

從GenBank已公布的數(shù)據(jù)中，下載棉花GhSAD2的基因序列(KX197920)，用GhSAD2-XbaⅠ和GhSAD2-SmaⅠ引物(表1)，從新陸早33的cDNA中克隆出大小約為1 200 bp左右的擴(kuò)增條帶(圖1)。將特異條帶切膠回收，然后連接PMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞后，用藍(lán)白斑篩選陽性克隆送測序公司測序。其測序結(jié)果通過DNAMAN多重序列對比分析，選取同源性最高的陽性質(zhì)粒用XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，得到約為1 200 bp的酶切小片段(圖2)，獲得預(yù)期目的基因。

M. DL2000；1～4. GhSAD2的PCR片段。M. DL2000；1-4. PCR fragment of GhSAD2.

M.DL2000；1～2. 雙酶切產(chǎn)物。M. DL2000；1-2. Fragment of double enzyme.

2.2 棉花GhSAD2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

回收約1.2 kb的酶切基因片段，與經(jīng)同酶切的表達(dá)載體pBI121約為14.7 kb的大片段相連接，獲得重組質(zhì)粒pBI121-GhSAD2(圖3)，重組載體中基本的載體骨架依舊為pBI121表達(dá)載體，本試驗(yàn)克隆得到的棉花GhSAD2基因是在CaMV35S下游XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點(diǎn)之間進(jìn)行插入的。通過雙酶切對重組子pBI121-GhSAD2進(jìn)行酶切，凝膠電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)約1 200 bp左右的片段，該片段的大小和目的片段大小基本是保持一致的，該跑膠結(jié)果說明重組的過表達(dá)載體pBI121-GhSAD2已經(jīng)成功構(gòu)建(圖4)。使用電擊儀將驗(yàn)證陽性的重組的過表達(dá)載體pBI121-GhSAD2導(dǎo)入到事先準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)中，經(jīng)GhSAD2F和GhSAD2R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀測電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠中出現(xiàn)和目的片段大小位置相同的特異片段(圖5)。該跑膠結(jié)果說明上述構(gòu)建的表達(dá)載體pBI121-GhSAD2已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101中并進(jìn)行表達(dá)。

圖3 pBI121-GhSAD2表達(dá)載體模式圖Fig.3 Diagram of expression voctor pBI121-GhSAD2

M.DL2000；1～2. 重組子雙酶切產(chǎn)物。M.DL2000；1-2. Recombinant double enzyme product.

M. DL2000；1～5. 重組質(zhì)粒pBI121-GhSAD2的擴(kuò)增產(chǎn)物。M. DL2000；1-5.Recombinant plasmid pBI121-GhSAD2 amplification product.

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定及GUS活性染色

通過對培養(yǎng)瓶中的再生煙草進(jìn)行抗性卡那霉素篩選，本試驗(yàn)共得到12株長勢較好的再生轉(zhuǎn)基因煙草植株，分別提取每個(gè)植株葉片的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，用GhSAD2-XbaⅠ和GhSAD2-SmaⅠ引物進(jìn)行擴(kuò)增，跑膠結(jié)果表明，其中有9株可以擴(kuò)增得到約1 200 bp的特異性條帶，而野生型煙草作為對照組沒有出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，此結(jié)果說明外源的棉花GhSAD2基因已經(jīng)整合到了煙草的基因組中，因此，可以得到pBI121-GhSAD2在煙草上的轉(zhuǎn)化率為75%。選取PCR跑膠結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，摘取其幼嫩的葉片(大小基本相同)分別進(jìn)行相同時(shí)間的GUS染色，染色完成后再分別脫色，脫色后轉(zhuǎn)GhSAD2基因煙草植株的葉脈中呈現(xiàn)出不同程度的藍(lán)色，野生型煙草葉片全呈黃白色(圖7)。表明外源GhSAD2基因連接載體pBI121后一起導(dǎo)入煙草中且能穩(wěn)定表達(dá)。

M. DL2000；1～12.轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草PCR產(chǎn)物；13. 重組子pBI121-GhSAD2擴(kuò)增產(chǎn)物；14. 野生型煙草DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。M. DL2000；1-12. Transgenic pBI121-GhSAD2 tobacco PCR product；13. Recombinant pBI121-GhSAD2 amplification product；14. Wild-type tobacco DNA amplification products.

A. 轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草；B. 野生型陰性對照。A.pBI121-GhSAD2 transgenic tobacco；B. Wild-type negative control.

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性鑒定

4 ℃低溫脅迫48 h后，轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草和野生型煙草均表現(xiàn)為植株和葉片萎蔫、下垂，但轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草較野生型煙草萎蔫程度較輕(圖8)。葉片相對電導(dǎo)率(REC)可以反映植物葉片細(xì)胞電解質(zhì)滲出情況，即細(xì)胞膜受損程度。在相同時(shí)間的低溫處理下，轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因2個(gè)株系的煙草T1、T2相對電導(dǎo)率顯著低于野生型煙草，但后兩者無顯著差異(圖9)。表明轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草的細(xì)胞膜受損程度要顯著低于野生型煙草。

A、C. 轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草；B. 野生型煙草。A，C. Transgenic pBI121-GhSAD2 tobacco；B. Wild type tobacco.

圖中的小寫字母a和b表示相同處理下不同株系處理間差異顯著程度(P<0.05)。The lowercase letters a and b in the figure indicate the significant difference in the treatment of different strains under the same treatment (P <0.05).

3 討論

棉花不僅提供紡織原料，也是我國重要的油料和飼用作物[37]。脂肪酸組成是決定食用油品質(zhì)的重要因素[38]。據(jù)報(bào)道，棉籽油中含有大量不飽和脂肪酸，其亞油酸的含量可超過 50%，具有較好的營養(yǎng)價(jià)值，是高質(zhì)量的食用油。脂肪酸去飽和酶Δ9-硬脂酰-ACP是目前研究最多、最廣泛的脂肪酸去飽和酶，因?yàn)樗粌H影響著植物脂肪酸的組成，也同時(shí)與植物抗寒性密切相關(guān)，而關(guān)于SAD與植物抗寒性關(guān)系研究已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

目前已從多種植物中分離獲得SAD基因的 cDNA，其中包括油菜[39]、芝麻[40]、油茶[41]、核桃[42]、棉花[32，43]等。SAD基因在高等植物的各個(gè)器官中均有表達(dá)，而表達(dá)模式和表達(dá)量存在差異。例如SAD基因在油樟的葉、種子、花中表達(dá)量較高，而在根和莖中表達(dá)量較低[42]。而在海濱錦葵中，SAD基因在其葉子中的表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量最低，SAD基因在海濱錦葵種子不同階段的表達(dá)量隨種子的發(fā)育而逐漸降低[44]。Liu等[43]通過 RNA干涉棉花SAD基因的表達(dá)，其棉籽的硬脂酸含量從正常的20%上升到40%，同時(shí)還伴隨棉籽油中棕櫚酸、油酸和亞油酸的減少。Wendy 等[17]將土豆的SAD基因轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)葉片和種子的脂肪酸組分發(fā)生了變化，其不飽和脂肪酸含量增加。目前，對SAD基因的研究大多集中在SAD基因的表達(dá)模式及其對脂肪酸含量及組分的變化上，在抗寒方面的研究，主要集中在低溫脅迫下SAD基因相關(guān)表達(dá)量的變化情況，但對于SAD基因在抗寒中的具體作用卻鮮有報(bào)道。本研究主要通過基因工程的手段克隆棉花GhSAD2基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-GhSAD2并將其轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，通過低溫下煙草的表型性狀及檢測其電解質(zhì)滲漏率，研究棉花GhSAD2基因在植株抗寒中的具體作用。研究結(jié)果顯示，陸地棉GhSAD2基因能夠顯著增強(qiáng)非低溫馴化植物煙草的抗寒性，從而提高植物細(xì)胞的低溫防御能力，但由于該研究中所用的轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草均為T0的煙草植株，所以該研究中對于抗寒性的研究結(jié)果只能作為基礎(chǔ)，對于GhSAD2基因在抗寒中的具體作用需要進(jìn)一步通過純合的高代植株及棉花直接來驗(yàn)證。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良棉花脂肪酸的組成及抗寒性是一項(xiàng)意義重大的工作，接下來將測定已純合的轉(zhuǎn)pBI121-GhSAD2基因煙草的各項(xiàng)生理指標(biāo)及脂肪酸成分來進(jìn)一步研究GhSAD2基因的抗寒作用。并將構(gòu)建好的過表達(dá)載體pBI-GhSAD2轉(zhuǎn)入棉花中直接研究其抗寒性，以期可以將其用于改善植物的抗寒性。

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