李培綱，李紅梅，張 帥，李勁松，陳志雄，劉向東

(華南農(nóng)業(yè)大學，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510642)

野生稻是水稻的野生近緣種，分布在中國的野生稻有普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻3種[1]。由于野生稻長期生長在自然環(huán)境中，具有豐富的遺傳多樣性，因此其保存有許多栽培稻已經(jīng)喪失的優(yōu)異基因[2-3]。藥用野生稻擁有許多優(yōu)良的抗性基因，比如抗褐飛虱、白背飛虱、白葉枯病基因等[4-5]。藥用野生稻對逆境脅迫具有耐受和抵抗的功能，這是水稻遺傳改良的重要材料[6]。常規(guī)遠緣雜交、胚培養(yǎng)、胚拯救、原生質(zhì)體融合、單體異源附加系、外源基因滲入系是藥用野生稻優(yōu)良基因資源發(fā)掘和利用的傳統(tǒng)方法[7-8]。Jena等[9]首次報道從5個藥用野生稻和2個栽培稻回交的高代 BC2F8獲得52個滲入系，第4，10和12染色體上的滲入片段與褐飛虱的抗性基因相關。文庫構建、轉(zhuǎn)基因、高通量測序技術的利用使更高效發(fā)掘和利用藥用野生稻優(yōu)良基因資源成為可能，如藥用野生稻BIBAC文庫[10]和藥用野生稻TAC文庫的構建[11]。劉蕊等[12]利用抗逆相關轉(zhuǎn)錄因子基因序列作為探針，從藥用野生稻 TAC文庫篩選出特異性克隆，通過遺傳轉(zhuǎn)化并篩選出抗非生物脅迫的轉(zhuǎn)基因材料，更有效地利用藥用野生稻有利基因。譚碧蘭[13]對20%PEG6000和未處理的藥用野生稻四葉期幼苗葉片的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行了測序分析，得到743個與野生稻干旱脅迫相關基因。

ADF(Actin depolymerizing factor/cofilin，ADF/cofilin)通過結合肌動蛋白，從而調(diào)控植物生長發(fā)育以及外界脅迫的響應[14-16]。目前，動物中一些ADF/cofilin蛋白的晶體結構被解析，如瘧原蟲(Malariaparasite)Pf ADF1 和 Pb ADF2[17-18]；一些植物的ADF/cofilin基因也已被分離和克隆，如水稻中OsADF3、擬南芥中AtADF2、AtADF4和AtADF5以及小麥中TaADF7可以提高植株對生物或非生物脅迫的耐受性和抗病性[19-23]。擬南芥中，AtADF1過量表達會導致細胞微絲束的長度變短[24]，AtADF7可以調(diào)控花粉管頂端的正常生長[25]，AtCDPK6基因可以調(diào)控擬南芥AtADF1N端的絲氨酸磷酸化過程，從而調(diào)節(jié)AtADF1與肌動蛋白的互作[26]，擬南芥第三亞家族ADFs基因的表達量能被高溫和低溫特異的誘導，但是其他ADFs缺少這一特征[27-28]，AtADF4在 ABA 和干旱誘導氣孔關閉過程中起作用[29]。玉米的ZmADF4與地中海玉米螟的抗性顯著相關[30]。還有研究表明，ADFs通過影響肌動蛋白的聚合與解聚來調(diào)節(jié)微絲骨架形成，并且ADFs的同源基因具有不同的表達模式[31]；基于肌動蛋白的進化，在植物中ADF的復制、亞功能化或者新功能化對于ADF蛋白的功能分化具有重要作用[32]。抵御病原時，小麥TaADF7蛋白通過改變肌動蛋白動力學來調(diào)節(jié)SOD積累、過敏反應，從而提高植株對條銹病的抵抗能力[33]。水稻中OsADF對花粉的形成和花粉管的伸長發(fā)揮著不同的作用，是花粉的特異性表達基因[34]。這些都說明，利用分子生物技術改善作物抗逆性和提高作物產(chǎn)量，逐漸成為一種解決糧食問題的重要途徑[35]。

近年來，高通量測序技術的利用促進了野生稻基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組學和基因進化等的研究，為有效地分離、克隆野生稻有利基因提供了基礎。譚碧蘭[13]分析了藥用野生稻干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并篩選出逆境脅迫相關的基因，其中OoADF1基因脅迫后，表達水平顯著提高。本試驗在此研究結果的基礎上，設計ADF特異性引物，通過PCR擴增、測序，從而克隆該基因；利用qRT-PCR技術研究了OoADF1的表達模式和脅迫處理后的表達變化特性，并選用原核表達載體初步探討了OoADF1基因?qū)Φ蜏?、高溫、干旱和高鹽等非生物脅迫下的抗逆特征，旨在為進一步研究藥用野生稻OoADF1的抗逆性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 藥用野生稻ADF基因的克隆與序列分析

藥用野生稻抗旱轉(zhuǎn)錄譜中Unigene(comp29080_c0)注釋為ADF家族基因，干旱脅迫后其表達水平提升5.4倍[13]。本試驗根據(jù)Unigene(comp29080_c0)的注釋，將它命名為OoADF1，利用Oligo 6.0軟件，設計引物OoADF1的上游引物(5′-ATGGCGAAC

GCGACATCAGAT-3′)和下游引物(5′-TTAGGAGGT

GTGGTCCTTGAGCACG-3′)以擴增其完整的開放閱讀框(ORF)。

試驗植物材料系廣西藥用野生稻，種植于華南農(nóng)業(yè)大學野生稻核心收集圃。選取幼嫩葉片，利用TRIzol法(Invitrogen公司)提取總RNA。采用FastQuant RT Kit (with gDNase)(天根生化科技有限公司)，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈。RT-PCR以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增體系為50 μL，內(nèi)含cDNA模板5 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、2×Taq Buffer 25 μL、DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL和ddH2O 17.5 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。其中OoADF1-F為5′-CCACATCTGATG

TCGCGTTCGCCAT5-3′；OoADF1-R為5′-CGTGCTCA

AGGACCACACCTCCTAA-3′。

1.2 實時熒光定量PCR

qRT-PCR反應體系：2×SuperReal Premix 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，Templete cDNA 2 μL和RNase-Free ddH2O 12 μL，其中cDNA模板為反轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一鏈(1∶10稀釋)，選Actin作為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應采用Roche-480儀器，反應體系為25 μL，根據(jù)Roche熒光定量試劑盒，反應程序：95 ℃預變性15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)擴增。融解曲線反應程序：由60 ℃遞進升溫到95 ℃，步進0.5 ℃，恒溫10 s。OoADF1上游引物為5′-ACGGCGGACGTGAG

GAGCAA-3′，OoADF1下游引物為5′-TTGAGCACGT

CGAGGGTGA-3′。內(nèi)參基因Actin上游引物為5′-GCTTCTAATTCTTCGGACCCAA-3′下游引物為5′-GGTTGAAAACTTTGTCCACGCTA-3′。

1.3 OoADF1基因原核表達

1.3.1 原核表達載體的構建 設計上游引物(5′-CGGGATCCATGGCGAACGCGACATCAGAT-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點序列)和下游引物(5′-CG

GAATTCTTAGGAGGTGTGGTCCTTGAGCACG-3′，下劃線為EcoRⅠ酶切位點序列)，擴增帶有酶切位點序列的OoADF1完整的CDS片段，瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收目的片段。將目的片段和原核表達載體pET-28a(+)分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，OoADF1目的片段的連接與pET-28a(+)采用T4連接酶(天根生化科技有限公司)。通過熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，挑取單克隆進行菌液PCR檢測并測序，將連接正確的質(zhì)粒命名為pET-28a-OoADF1。

1.3.2 重組原核表達載體的轉(zhuǎn)化和誘導表達 利用熱激法將重組質(zhì)粒pET-28a-OoADF1與pET-28a分別轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中，用LB(50 mg/L Kan)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選挑取陽性單克隆進行菌液PCR驗證，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?00 μL菌液接種到3 mL LB(50 mg/L Kan)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后將菌液按1∶50的比例加入到100 mL LB(50 mg/L Kan)培養(yǎng)基中，150 r/min 、37 ℃ 搖床擴大培養(yǎng)2～3 h，OD600為0.6時，從擴大培養(yǎng)物中取分別取4 mL菌液加入不同濃度的IPTG進行誘導表達(150 r/min 、37 ℃)，分別誘導1，2，3，4 h，同時收集未經(jīng) IPTG 誘導的pET-28a(+)和pET-28a-OoADF1作為空白對照。5 000 r/min、2 min收集菌體，加入1 mL 滅菌水洗滌沉淀，8 000 r/min離心2 min，棄上清。在收集的菌體中加入200 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，收集上清4 ℃ 保存?zhèn)溆?。配置SDS-PAGE分離膠與濃縮膠，樣品點30 μL，恒壓70 V電泳，溴酚藍至膠槽底部時，停止電泳，然后進行考馬斯亮藍過夜染色，蒸餾水沖洗干凈后，倒入考馬斯亮藍脫色液脫色至膠背景透明。

1.3.3 高鹽脅迫下重組菌株BL21(DE3)生長曲線測定和菌落數(shù)分析 保存的菌液接種于LB(50 mg/L Kan)培養(yǎng)基中過夜活化。按1∶100接種量分別接種于LB、LB(500 mmol/ L NaCl)和LB(600 mmol/L NaCl)的LB液體培養(yǎng)基中，再分別加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測定其OD600值，用SigmaPlot12繪制生長曲線，重復3次。

將含有pET-28a-OoADF1、pET-28a(+)的BL21重組菌株經(jīng)最適濃度的IPTG誘導培養(yǎng)2 h至OD600為1.0。菌體經(jīng)4 500 r/min離心5 min之后用無菌水重懸菌體，調(diào)OD600至1.0。取100 μL重懸菌液稀釋至1 mL，混勻后再從中取100 μL菌液稀釋至1 mL，如此依次稀釋到第6級。取100 μL菌液分別涂布在含有不同濃度的LB(50 mg/L Kan)培養(yǎng)基平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計菌落個數(shù)，試驗3次重復。

2 結果與分析

2.1 OoADF1的序列分析

轉(zhuǎn)錄譜測序結果分析發(fā)現(xiàn)，藥用野生稻經(jīng)20% PEG模擬干旱脅迫后，表達水平上升的Unigene有459個，其中comp29080_c0的表達水平上升5.4倍，注釋為肌動蛋白結合蛋白(Actin depolymerizing factor/cofilin，ADF/cofilin，ADF)[13]。利用EditSeq軟件分析表明，comp29080_c0總長為1 158 bp，推測ORF長度為453 bp。RT-PCR擴增片段的長度與預測相符(圖1-A)，切膠回收并測序，MegAlign雙序列比對表明，擴增片段的序列與comp29080_c0預測的ORF序列一致，ORF長度為453 bp，推測編碼150個氨基酸殘基。利用PFAM(http：//pfam.xfam.org/search)搜索發(fā)現(xiàn)，comp29080_c0 ORF 推測的氨基酸序列含有完整ADF結構域的基因，命名為OoADF1。為了研究OoADF1的基因組序列是否有內(nèi)含子，以藥用野生稻基因組DNA為模板，應用高保真酶和特異性引物OoADF1-F和OoADF1-R進行OoADF1基因組DNA擴增，獲得預測大小長度的條帶(圖1-B)，回收條帶，并與T載體連接，菌液PCR鑒定后，提取重組質(zhì)粒并送樣測序，獲得OoADF1的基因組序列，在GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)上進行基因結構分析，結果顯示，OoADF1基因無內(nèi)含子。BlastP搜索結果發(fā)現(xiàn)，單子葉植物中存在許多OoADF1的同源基因，從中選出栽培稻同源基因OsADF1、3、5、6、7、9、10和11，與OoADF1進行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，OoADF1與OsADF3聚成一類，并有高自展值支持(圖2)。雙序列比對結果發(fā)現(xiàn)，OoADF1和OsADF3的氨基酸長度均為150個，兩者僅存在5個氨基酸的差異，氨基酸序列相似性高達96.7%，表明兩者具有很高的同源性。

A和B圖中泳道1分別為OoADF1的cDNA和基因序列擴增條帶；M.Marker 2000。A.Amplification of OoADF1 cDNA；B.Amplification of OoADF1genome；M.DNA Marker 2000.

圖2 藥用野生稻與栽培稻ADF氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis on amino acid sequences of ADF in Oryza officinalis and Oryza sativa

2.2 藥用野生稻OoADF1基因表達模式分析

為了分析藥用野生稻OoADF1的組織表達特性，以幼苗四葉期葉片、葉鞘和根、抽穗期的葉片、葉鞘、莖和幼穗等7個組織的cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，結果表明，OoADF1在四葉期的葉片、葉鞘、根、抽穗期的葉片、葉鞘、莖和幼穗等7個組織中均表達，四葉期根部表達量最高，抽穗期葉鞘表達量最高，隨著生長發(fā)育，營養(yǎng)器官OoADF1表達水平逐漸變大(圖3)，OoADF1在各組織中均有表達，不具有表達的組織特異性。

為了探討藥用野生稻OoADF1的抗逆特性，對藥用野生稻四葉期幼苗進行干旱、高溫、低溫和高鹽脅迫處理，選取不同處理和未處理幼苗葉片，用TRIzol法提取總RNA，qRT-PCR擴增結果表明，OoADF1在不同脅迫下的表達量均有上調(diào)，在干旱和高鹽濃度脅迫時表達量上調(diào)倍數(shù)較大；OoADF1在干旱脅迫時最高表達水平比對照上調(diào)了17.9，在高鹽脅迫時最高表達水平比對照上調(diào)了40.0倍，4 ℃或42 ℃脅迫時，OoADF1最高表達水平分別上調(diào)9.7，7.2倍；OoADF1在低溫和干旱脅迫早期表達水平變化較大，后期較??；高鹽脅迫時，隨著時間變長，表達水平變化倍數(shù)增加(圖4)。結果表明，藥用野生稻OoADF1可能參與干旱、高溫、低溫和高鹽等非生物脅迫調(diào)控。

FLB.四葉期葉片；FLS.四葉期葉鞘；FLR.四葉期根；HSB.抽穗期葉片；HSS.抽穗期葉鞘；HSSt.抽穗期莖；HSSd.抽穗期幼穗。

FLB.Leaf blade at four-leaves stage；FLS.Leaf sheath at four-leaves stage；FLR.Root at four-leaves stage；HSB.Blade at heading stage；HSS.Sheath at heading stage；HSSt.Stem at heading stage；HSSd.Young panicle at heading stage.

圖3藥用野生稻OoADF1在藥用野生稻各組織表達水平
Fig.3ExpressionlevelofOoADF1invarioustissuesofOryzaofficinalis

2.3 藥用野生稻OoADF1蛋白的誘導表達

為了探討OoADF1所編碼的特異蛋白的表達特性，將OoADF1的ORF序列融合到原核表達載體pET-28a(+)質(zhì)粒中，構建了藥用野生稻OoADF1基因的原核表達載體pET-28a-OoADF1。采用不同誘導時間和不同IPTG濃度對原核表達體系進行優(yōu)化。IPTG濃度梯度優(yōu)化試驗結果(圖5)表明，當IPTG終濃度小于0.2 mmol/L時，融合蛋白表達量隨著濃度增加而變大；當IPTG終濃度大于0.2 mmol/L時，融合蛋白表達量則逐漸變低。誘導時間梯度優(yōu)化試驗結果表明，隨著誘導時間增加，融合蛋白表達量增加，但誘導時間超過3 h，表達量增加不顯著，所以誘導3 h時是最佳的誘導蛋白表達時間。SDS-PAGE檢測結果顯示，重組子pET-28a-OoADF1蛋白分子質(zhì)量約為23 kDa，載體pET-28a(+)閱讀框編碼的蛋白大小約為7 kDa，因此OoADF1蛋白的分子質(zhì)量為16 kDa，這一結果與預測大小相符。

2.4 藥用野生稻OoADF1高鹽脅迫抗性分析

為進一步了解OoADF1在生物體中對脅迫響應的作用，用轉(zhuǎn)入重組子pET-28a-OoADF1和pET-28a(+)的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，涂布在含濃度為0，500，600 mmol/L NaCl的LB液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導，在恒溫搖床(37 ℃、150 r/min)中連續(xù)培養(yǎng)35 h，期間每隔2 h測定OD值并觀察其生長曲線。結果表明，轉(zhuǎn)入重組子pET-28a-OoADF1的菌株在正常培養(yǎng)和高鹽脅迫條件下，菌液活力均較對照高，說明表達OoADF1的菌株不僅能夠在正常條件下生活力比對照高，而且能夠更好地耐受高濃度NaCl的脅迫(圖6-A-C)。進一步將重組子pET-28a-OoADF1和pET-28a(+)涂布于含有不同濃度的NaCl固體LB培養(yǎng)基上，在37 ℃下生長18 h，pET-28a-OoADF1菌株在400，600 mmol/L NaCl固體培養(yǎng)基上能夠長出較多的菌落，在800 mmol/L NaCl固體培養(yǎng)基上未長菌落(圖6-D)。結果表明，該OoADF1基因表達的蛋白質(zhì)耐受一定濃度的高鹽脅迫。

A.4 ℃；B.42 ℃；C.20% PEG-6000；D.200 mmol/L NaCl。

M.蛋白Marker(94，60，45，27，18 kDa)；1.未經(jīng)IPTG誘導的載體pET-28a(+)；2.未經(jīng)IPTG誘導的重組子pET-28a-OoADF1；3～7.經(jīng)終濃度分別為0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mmol/L的IPTG誘導重組子pET-28a-OoADF1；A、B、C、D分別為經(jīng)IPTG誘導1，2，3，4 h；箭頭是特異蛋白。M.Protein Marker(94，60，45，27，18 kDa)；1.pET-28a(+) with no IPTG induce；2.pET-28a-OoADF1 with no IPTG induce；3-7.pET-28a-OoADF1 with IPTG induce(final concentration：0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mmol/L)；A，B，C，D.IPTG induce with 1，2，3，4 h；Arrow is specific protein.

3 討論與結論

模式植物擬南芥和水稻基因組中分別存在12，15個ADF家族成員，部分成員分子生理功能和作用已得到系統(tǒng)研究確認[15，36]。本研究利用藥用野生稻(CC染色體組)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄譜組裝序列，成功克隆了藥用野生稻的ADF基因OoADF1的ORF為453 bp，編碼150個氨基酸殘基，具有典型的ADF結構域。OoADF1與OoADF3氨基酸序列相似性高達96.7%，兩者具高度同源性，預測著藥用野生稻(CC組)和栽培稻(AA組)分化之前就存在ADF的共同祖先。OoADF1在幼苗的根中和抽穗期的葉鞘中表達最高，而在穗部表達較低。OsADF3主要在90 d栽培稻日本晴的莖、葉片、鞘和穗表達，12 d日本晴的莖中微弱表達[19]，兩者具有相似的組織表達模式。已有研究表明，植物肌動蛋白在應激生物脅迫和非生物脅迫起著重要作用[37-38]。日本晴和中花8苗期OsADF3受干旱和滲透脅迫誘導，而不受鹽、冷和ABA誘導[39]。然而Yan等[40]指出，日本晴根部OsADF3蛋白受鹽脅迫誘導，并且Chen等[41]認為OsADF3蛋白受外源ABA誘導，與根部生長和發(fā)育過程中形態(tài)特性變化相關。Huang等[19]的研究結果表明，OsADF3受鹽、ABA、干旱和冷等4種非生物脅迫誘導表達。研究結果表明，OoADF1受低溫、高溫、高鹽和干旱等不同脅迫誘導表達，大腸桿菌BL21(D23)表達融合蛋白pET-28a-OoADF1在高鹽脅迫下表現(xiàn)出更強的生活力，表明該基因能夠提升菌株的耐鹽性。本研究結果為進一步探討藥用野生稻OoADF1抗逆脅迫功能提供了堅實基礎。

A、B、C.正常、500 mmol/L NaCl和600 mmol/L NaCl下對照菌株和重組pET-28a-OoADF1菌株的生長曲線；D.高鹽脅迫下重組pET-28a-OoADF1大腸桿菌菌落數(shù)量統(tǒng)計。A，B，C.Growth curve of contrast and recombination pET-28a-OoADF1 Escherichia coli with 0，500，600 mmol/L NaCl；D.Quantity statistics of colony pET-28a-OoADF1 of bacteria of Escherichia coli.

藥用野生稻OoADF1的ORF長度為453 bp，編碼150個氨基酸殘基。OoADF1在四葉期幼苗的根中和抽穗期的葉鞘中表達量最高；OoADF1均在高溫、干旱和高鹽濃度脅迫時表達量上調(diào)較大，其中在干旱和高鹽脅迫時表達量較對照分別上調(diào)了17.9，40.0倍；OoADF1蛋白分子量約為16 kDa，且在IPTG終濃度為0.2 mmol/L時誘導蛋白表大量最大。經(jīng)用轉(zhuǎn)入重組子的大腸桿菌BL21(DE3)菌株分別進行500，600 mmol/L NaCl(液體)脅迫處理，經(jīng)處理之后菌株與對照菌株相比，均能夠更好地耐受高濃度NaCl的脅迫，由此表明了OoADF1能夠在一定程度上相應鹽脅迫使細胞免受高鹽的毒害。

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