王曉丹，肖 鋼，常 濤，張振乾，官春云，鄔賢夢(mèng)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

含油量與脂肪酸組成是評(píng)價(jià)油菜品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。低芥酸、低α-亞麻酸與高油酸、高亞油酸一直是我們所追求的營養(yǎng)品質(zhì)方面的重要育種目標(biāo)之一，目前育成的高油酸油菜籽粒油酸含量高于75%，有些甚至高達(dá)90%以上[2-3]。高油酸菜籽油有較高的營養(yǎng)，且有利于人體心血管健康，因而近年來有較多高油酸油菜相關(guān)的研究[4-6]，但其脂肪酸代謝分子生物學(xué)機(jī)理研究仍未完全清楚。

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)定量精確、有較高的鑒定率，可鑒定多達(dá)6 000種蛋白，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)[7-8]。轉(zhuǎn)錄組測序是一種高通量測序技術(shù)，精確性高，成本低，得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析可以從不同層面研究基因表達(dá)的情況，得到生物體更加完整的表達(dá)信息[11]。目前，利用蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的研究在水稻、擬南芥、紫花苜蓿等許多植物中有了應(yīng)用[12-14]，但在高油酸油菜上仍未有相關(guān)應(yīng)用。

為了更好地了解高油酸油菜的調(diào)控機(jī)理，本研究以一組高油酸近等基因系材料自交授粉后20～35 d新鮮、無病害的種子為材料，結(jié)合iTRAQ技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析，以期找到其中顯著差異表達(dá)的蛋白與基因，促進(jìn)對(duì)其相關(guān)代謝路徑的分子機(jī)理研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

高油酸油菜近等基因系材料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究中心提供，高低油酸品系油酸含量分別為81.4%，56.2%。2012年9月28日種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地，取自交套袋20～35 d的種子混合保存于超低溫冰箱(-80 ℃)備用。

1.2 iTRAQ聯(lián)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)分析差異表達(dá)蛋白

采用TCA/丙酮法提取蛋白后，測定蛋白質(zhì)濃度(Bradford定量法)，并進(jìn)行電泳檢測(12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠)。37 ℃取等量蛋白加入胰蛋白酶酶解。再等量混合用iTRAQ試劑標(biāo)記的酶解肽段，用強(qiáng)陽離子交換色譜(Strong cation exchange choematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離。然后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。另外，本研究所用數(shù)據(jù)庫為白菜與甘藍(lán)數(shù)據(jù)庫，以Mascot 2.3.02對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，該試驗(yàn)由深圳華大公司完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析差異表達(dá)基因

用TRNzol法提取授粉后20～35 d種子的RNA，檢測合格后，將該種子樣品送往深圳華大公司測序。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

以低油酸材料為對(duì)照，通過上述結(jié)果，以蛋白表達(dá)差異倍數(shù)≥1.5，P值≤0.05：基因表達(dá)差異倍數(shù)≥2，P值≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計(jì)算Person相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.1.1 iTRAQ定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù) 通過iTRAQ技術(shù)共得到譜圖340 528張，Mascot 2.3.02分析匹配到67 334張，共鑒定到4 726個(gè)蛋白。按1.4篩選差異表達(dá)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，共得到334個(gè)差異蛋白，其中148個(gè)上調(diào)表達(dá)，186個(gè)下調(diào)表達(dá)(表1)。

2.1.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 通過Illumina HiseqTM2000測序及除雜處理后，有24 345個(gè)基因被注釋，按照篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，高低油酸材料間，有2 043個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生了改變，其中256個(gè)上調(diào)表達(dá)，53個(gè)下調(diào)表達(dá)(表1)。

2.2 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)數(shù)量關(guān)系 將經(jīng)鑒定的蛋白與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)(當(dāng)某一個(gè)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄組水平有表達(dá)量時(shí)，被認(rèn)為兩者相關(guān)聯(lián))。得到在鑒定、定量、顯著差異3個(gè)范圍中，能關(guān)聯(lián)到的蛋白質(zhì)和基因數(shù)量關(guān)系如表2。有2 604個(gè)基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平被鑒定，其中在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)的基因2 019個(gè)，而在334個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白中與基因關(guān)聯(lián)的有87個(gè)。

2.2.2 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性 本研究中，依據(jù)mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)結(jié)果，從所有定量蛋白和基因的關(guān)聯(lián)表達(dá)、蛋白質(zhì)與基因變化趨勢(shì)相同的關(guān)聯(lián)表達(dá)與蛋白質(zhì)和基因變化趨勢(shì)相反的關(guān)聯(lián)表達(dá)3個(gè)方面，分別對(duì)蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1，定量蛋白和基因關(guān)聯(lián)系數(shù)為-0.326 9；變化趨勢(shì)相同差異蛋白和基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)系數(shù)為0.714 3；變化趨勢(shì)相反差異蛋白和基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)系數(shù)為-0.735 8，蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性并不高。

表2 關(guān)聯(lián)到的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)量Tab.2 Number of associated proteomics and transcriptomics

從左到右依次為：所有定量蛋白質(zhì)和基因的關(guān)聯(lián)表達(dá)；變化趨勢(shì)相同的差異蛋白和基因的關(guān)聯(lián)表達(dá)；變化趨勢(shì)相反的差異蛋白和基因的關(guān)聯(lián)表達(dá)。The pictures from left to right are the expression of all quantitative proteins and genes;The same expression of differential proteins and genes；The opposite expression of differential protein and gene.

2.2.3 脂肪酸代謝相關(guān)蛋白與基因的關(guān)聯(lián)分析 與差異蛋白變化趨勢(shì)相同的基因：本研究中，將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有80個(gè)與差異蛋白變化趨勢(shì)相同的差異基因，其中有54個(gè)上調(diào)表達(dá)，26個(gè)下調(diào)表達(dá)。GO注釋表明這些基因涉及代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御與脅迫應(yīng)答、氧化還原、轉(zhuǎn)錄等方面功能。其中與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有23個(gè)，16個(gè)上調(diào)表達(dá)，7個(gè)下調(diào)表達(dá)(表3)。

?；o酶A家族在脂肪酸合成過程發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，F(xiàn)ae1基因編碼控制3-酮酰-輔酶合成酶(KCS)，是長鏈脂肪酸合成的限速酶，半胱氨酸是KCS催化中心不可或缺的氨基酸[15-16]。而?；?ACP硫脂酶是脂肪酸合成酶(Fatty acid symthase，F(xiàn)AS)體系的組成部分[17]，本研究關(guān)聯(lián)到與脂肪酸合成相關(guān)的差異基因8個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)6個(gè)，下調(diào)表達(dá)2個(gè)(表3)，除了驗(yàn)證了前人所做的工作之外，gi|297330358(庚二酰ACP甲基酯的羧酸酯酶)、gi|297321940(磷酸化酶)、gi|297314818(乙酰胺、甲酰胺酶家族)3個(gè)推定蛋白有待于后續(xù)研究。

種子發(fā)育過程，蔗糖是合成脂肪酸的主要碳源，通過卡爾文循環(huán)轉(zhuǎn)為丙酮酸，又氧化形成脂肪酸合成的前體物乙酰CoA[18]。植物體脂肪酸合成位點(diǎn)主要在質(zhì)體，那么脂肪酸到細(xì)胞其他位點(diǎn)發(fā)揮作用必然有信號(hào)傳遞與運(yùn)輸?shù)倪^程，溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶是脂肪酸修飾作用的關(guān)鍵酶[19]。此外，能量代謝是脂肪酸代謝必不可少的一環(huán)，無論是脂肪酸的生物合成、分解以及運(yùn)輸過程都涉及能量的轉(zhuǎn)化。本研究關(guān)聯(lián)到的與糖代謝相關(guān)的基因有4個(gè)，均上調(diào)表達(dá)；關(guān)聯(lián)到的與膜與轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的差異表達(dá)基因有4個(gè)，其中3個(gè)上調(diào)表達(dá)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)；關(guān)聯(lián)到7個(gè)與能量轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中3個(gè)上調(diào)表達(dá)，4個(gè)下調(diào)表達(dá)(表3)。這些基因可能對(duì)脂肪酸整個(gè)代謝過程有重要意義。

蛋白顯著差異表達(dá)，mRNA無顯著變化：將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有247個(gè)在蛋白水平有表達(dá)變化而轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化的基因，其中92個(gè)上調(diào)表達(dá)，155個(gè)下調(diào)表達(dá)。與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有25個(gè)，其中10個(gè)上調(diào)表達(dá)，15個(gè)下調(diào)表達(dá)(表4)。

mRNA顯著差異表達(dá)，蛋白無顯著變化：關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)有231個(gè)在mRNA水平有表達(dá)變化，在蛋白水平無顯著變化，其中106個(gè)上調(diào)表達(dá)，25個(gè)下調(diào)表達(dá)。與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有24個(gè)，其中18個(gè)上調(diào)表達(dá)，6個(gè)下調(diào)表達(dá)(表5)。

表3 關(guān)聯(lián)到與差異蛋白變化趨勢(shì)相同的脂肪酸代謝相關(guān)的差異基因Tab.3 Differentially expressed genes associated with fatty acid metabolism

注：+.上調(diào)；-.下調(diào)。表4-5同。

Note:+.Up;-.Down.The same as Tab.4-5.

表4 蛋白顯著差異表達(dá)，mRNA無顯著變化的基因Tab.4 The differential genes with significantly change in protein express and indistinctively in mRNA

表5 mRNA顯著差異表達(dá)，蛋白無顯著變化Tab. 5 The differential genes with significantly change in mRNA express and indistinctively in protein

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)高低油酸材料進(jìn)行蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組分析，得到定量蛋白和基因關(guān)聯(lián)系數(shù)為-0.326 9；變化趨勢(shì)相同差異蛋白和基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)系數(shù)為0.714 3；變化趨勢(shì)相反差異蛋白和基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)系數(shù)為-0.735 8，蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性并不高。

將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有80個(gè)與差異蛋白變化趨勢(shì)相同的差異基因，GO注釋表明這些基因涉及代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御與脅迫應(yīng)答、氧化還原、轉(zhuǎn)錄等方面功能。其中與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有23個(gè)，其中16個(gè)上調(diào)表達(dá)，7個(gè)下調(diào)表達(dá)。蛋白水平有表達(dá)變化而轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化的247個(gè)基因中，與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有25個(gè)，其中10個(gè)上調(diào)表達(dá)，15個(gè)下調(diào)表達(dá)。在mRNA水平有表達(dá)變化而蛋白水平無顯著變化的231個(gè)基因中，與脂肪酸代謝過程相關(guān)的有24個(gè)，其中18個(gè)上調(diào)表達(dá)，6個(gè)下調(diào)表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組學(xué)發(fā)展的熱點(diǎn)領(lǐng)域，兩者關(guān)聯(lián)分析可以更全面的了解基因表達(dá)情況，通過相互間的補(bǔ)充與對(duì)比，從而得到更完整的生物信息，以便為后續(xù)研究做準(zhǔn)備[20-21]。

但目前研究發(fā)現(xiàn)，兩者之間相關(guān)性比較低[22]。李茂峰[23]采用基因芯片與iTRAQ技術(shù)，比較了纖維初始發(fā)育期4個(gè)纖維正常發(fā)育的陸地棉品種(系)之間的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有240個(gè)基因可以找到270個(gè)對(duì)應(yīng)的或高度同源的蛋白質(zhì)，其中僅有7個(gè)基因表現(xiàn)一致，絕大多數(shù)不一致，相關(guān)系數(shù)僅為0.029。Kubala等[24]使用微陣列技術(shù)與2-DE雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)PEG處理甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程關(guān)鍵基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組分析，差異表達(dá)蛋白78個(gè)，12個(gè)蛋白在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組水平差異表達(dá)一致，相關(guān)系數(shù)也僅有0.15。本研究發(fā)現(xiàn)，高油酸材料定量蛋白和基因的表達(dá)呈現(xiàn)較低的負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能是由于轉(zhuǎn)錄與翻譯水平并不一致所致[22]。此外，差異基因與蛋白的表達(dá)趨勢(shì)相反，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系表明，轉(zhuǎn)錄后的翻譯修飾等調(diào)控有重要作用[25]。

本研究利用蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析，挖掘高油酸材料參與脂肪酸代謝的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)有23個(gè)基因在蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組均有顯著差異，這些基因可能為解釋高油酸高脂肪酸代謝機(jī)理做出解答，其中g(shù)i|297330358(庚二酰ACP甲基酯的羧酸酯酶)、gi|297321940(磷酸化酶)、gi|297314818(乙酰胺、甲酰胺酶家族)3個(gè)推定蛋白有待于后續(xù)研究。

[1] 劉后利. 油菜遺傳育種學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[2] 涂金星，張冬曉，張 毅，等. 我國油菜育種目標(biāo)及品種審定問題的商榷[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2007，29(3)：350-352.

[3] 高建芹，浦惠明，戚存扣，等. 高含油量油菜種子和果皮油分積累及主要脂肪酸的動(dòng)態(tài)變化[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2009，31(2)：173-179.

[4] Nicolosir J，Woolfrey B，Wilson T A，et al. Decreased aortic early atherosclerosis and associated risk factors in hypercholesterolemic hamsters fed a high-or mid-oleic acid oil compared to a high-linoleic acid oil[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry，2004，15(9)：540-547.

[5] Rudkowska I，Roynette C E，Nakhasi D K，et al. Phytosterols mixed with medium-chain triglycerides and high-oleic canola oil decrease plasma lipids in overweight men[J]. Metabolism-Clinical and Experimental，2006，55(3)：391-395.

[6] 張振乾，胡慶一，官春云. 高油酸油菜研究現(xiàn)狀、存在的問題及發(fā)展建議[J]. 作物研究，2016，30(4)：462-474.

[7] 喻娟娟，戴紹軍. 植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究若干重要進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2009，44(4)：410-425.

[8] 張 楊，孫 明. iTRAQ技術(shù)在植物蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2013，11(1)：1047-1051.

[9] 陳 勇，柳亦松，曾建國. 植物基因組測序的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究，2014，18(1)：66-74.

[10] 許 波，張偉強(qiáng)，馮曉曦，等. 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在玉米中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 玉米科學(xué)，2014，22(1)：67-72.

[11] Lan P，Li W F，Schmidt W. Complementary proteome and transcriptome profiling in phosphate-deficientArabidopsisroots reveals multiple levels of gene regulation[J]. Molecular & Cellular Proteomics，2012，11(11)：1156-1166.

[12] Li M，Wang K，Li S，et al. Exploration of rice pistil responses during early post-pollination through a combined proteomic and transcriptomic analysis[J]. Journal of Proteomics，2016，131(131)：214-226.

[13] Sinha R，Kumar D，Datta R，et al. Integrated transcriptomic and proteomic analysis ofArabidopsisthalianaexposed to glutathione unravels its role in plant defense[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2015，120(3)：975-988.

[14] 張振亞，裴翠明，馬 進(jìn).基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)研究技術(shù)篩選紫花苜蓿耐鹽相關(guān)候選基因[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2016(3)：317-324.

[15] 李曉丹. 油料作物種子脂肪酸累積模式及相關(guān)基因的克隆與序列比較研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[16] Ohlrogge J，Browse J. Lipid biosynthesis[J]. The Plant Cell，1995，7(7)：957.

[17] 王 倩. 擬南芥脂肪酸代謝相關(guān)基因的克隆與功能分析[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[18] 王鏡巖，朱圣庚，徐長法. 生物化學(xué) (下冊(cè))[M].北京：高等教育教育出版社，2002.

[19] 官玲亮. 紅花(CarthamustinctoriusL.)不同組織多不飽和脂肪酸積累模式及調(diào)控機(jī)制[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[20] Dyhrman S T，Jenkins B D，Rynearson T A，et al. The transcriptome and proteome of the diatomThalassiosirapseudonanareveal a diverse phosphorus stress response[J]. PLoS One，2012，7(3)：1643-1646.

[21] Gonzalez L M G，ElKayal W，Ju C J T，et al. Integrated transcriptomic and proteomic profiling of white spruce stems during thetransition from active growth to dormancy [J].Plant Cell Environ，2012：35(4)：682-701.

[22] 吳松峰，朱云平，賀福初.轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組比較研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32(2)：99-105.

[23] 李茂峰. 不同農(nóng)藝性狀棉花品種(系)纖維初始發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的比較分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[24] Kubala S，Garnczarska M，Wojtyla，et al，Deciphering priming-induced improvement of rapeseed (BrassicanapusL.) germination through an integrated transcriptomic and proteomic approach[J].Plant Science，2015，231：94-113.

[25] Galland M，Huguet R，Arc E，et al.Dynamic proteomics emphasizes the importance of selective mRNA translation and protein turnover duringArabidopsisseed germination[J]. Mol Cell Proteomics，2014，13 (1)：252-268.