王英澤，王巧蘭，曹晴晴，付 育，劉 暢，王晨晨，杜 朝

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

基因編輯是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域革命性的技術(shù)進步，它的建立得益于對細菌適應(yīng)性免疫機制的深刻認識，以CRISPR/Cas9為代表的基因組修飾技術(shù)，可以有效實現(xiàn)對細胞或動植物的基因進行特定修飾(敲除、編輯、激活或阻遏轉(zhuǎn)錄、功能基因篩選、基因表觀調(diào)控等)[1-12]。CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)高效、易于操作和廉價的優(yōu)點使之迅速應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域[13-16]，除了在醫(yī)學(xué)方面極具誘人前景，這一系統(tǒng)在作物分子育種方面也將大有作為。有學(xué)者指出，只要靶點恰當(dāng)，Cas9在植物中會有較高的編輯效率和特異性[17-19]，并且轉(zhuǎn)基因植物的后代通過自交和回交等手段，容易克服脫靶問題。最近，我國科學(xué)家利用單堿基編輯技術(shù)成功創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因抗除草劑擬南芥[20]，就是基因編輯技術(shù)在植物育種方面的成功范例，相對傳統(tǒng)誘變方式創(chuàng)制抗除草劑點突變，基因編輯技術(shù)表現(xiàn)出效率高、周期短、成本低的特點，而且可以克服產(chǎn)生連鎖的不良突變問題。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本機制是CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切酶(CRISPR-associated endonuclease)Cas9 在指導(dǎo)RNA(Guide RNA，gRNA)的指導(dǎo)下，對基因組上的靶序列進行切割，產(chǎn)生雙鏈斷口(Double strand break，DSB)。DSB隨后由2種廣泛存在的修復(fù)途徑中的一種修復(fù)：一種是有效而易錯的非同源末端連接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)途徑，這一途徑將DSB重新連接，但常常導(dǎo)致在雙鏈斷口處小核苷酸片段的插入缺失(Insertions or deletions，indels)，其中有些會導(dǎo)致靶基因失活，形成基因敲除。另一種途徑是效率較低但高保真的同源指導(dǎo)修復(fù)途徑(Homology Directed Repair，HDR)。HDR可以用來按研究人員意志在靶位點引入特異的序列變化，形成基因編輯(Gene edit)。為了進行基因編輯，除了Cas9和gRNA這2個組分之外，還需要一個外源的修復(fù)模板，修復(fù)模板必須含有目的序列。

質(zhì)粒是常用的修復(fù)模板形式，由于它含有目的序列，所以稱作供體質(zhì)粒(Donor plasmid)，又因為編輯的分子機制是同源重組，所以也稱作同源重組載體。構(gòu)建同源重組載體時，一般首先以PCR擴增得到緊鄰靶序列的上下游各約500～750 bp的片段(稱作5′、3′同源臂或左右同源臂)，然后分別克隆至同源重組空載體上目的序列的兩側(cè)。目前，這類空載體有很多，一般具有2個正選擇基因和一個負選擇基因；所用克隆方法有多種，有的采用經(jīng)典的酶切-連接方法，有的采用方便目的片段在各種表達載體之間穿梭的Gateway方法，有些采用適合文庫構(gòu)建的USER(Uracil-specific excision reagent)方法[21]。有些分子生物學(xué)試驗，比如基因功能初步鑒定，只需敲除目的基因就能夠滿足要求，通過在目的基因引入便于篩選的NeoR就能實現(xiàn)。因此，利用現(xiàn)有載體pcDNA3.1(+)-HA-His的原核篩選標記AmpR基因、復(fù)制原點和真核篩選標記NeoR基因構(gòu)建了一個新的同源重組載體pAmpR-NeoR，并在NeoR兩側(cè)分別引入了一個克隆位點。結(jié)果顯示，運用這一載體構(gòu)建供體質(zhì)粒，與CRISPR/Cas9系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染B16細胞，藥物篩選14 d后，Junction PCR檢測發(fā)現(xiàn)NeoR整合到靶序列，實現(xiàn)了編輯。同時，載體的克隆位點是應(yīng)用便利的BamH Ⅰ和XhoⅠ位點，使其具有序列通用性、良好的擴展性和靈活性，便于根據(jù)需要進行改造，以滿足具體試驗的不同要求。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒載體與細胞株 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HA-His、pST1374-N-NLS-Flag-linker-Cas9-BSD(簡稱pST-Cas9)和pGL3-U6 sgRNA-PGK-Puro mut BsaI ACCG(簡稱pGL3-U6 sgRNA)，以及小鼠黑色素瘤細胞B16均為河北科技大學(xué)細胞工程研究室保存。

1.1.2 試驗試劑 2×Pfu PCR StarMix with Loading Dye和2×TaqPCR StarMix with Loading Dye(康潤誠業(yè)，北京)；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、BamH Ⅰ、BglⅡ與小牛堿性磷酸酶(CIAP)(寶生物，大連)；T4DNA連接酶、Trans1-T1 感受態(tài)細胞(全式金，北京)；質(zhì)粒小提、普通DNA產(chǎn)物純化、瓊脂糖凝膠DNA回收和血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)；DMEM培養(yǎng)基(Gibico)；胎牛血清(Hyclone)；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen)。

1.1.3 引物與寡核苷酸 擴增NeoR基因的引物(下劃線表示酶切位點，下同)：NeoR上游5′-CGGGATCCCTGTGGAATGTGTGTCAGTT-3′(BamH Ⅰ)，NeoR下游5′-CCGCTCGAGCAGACATGATAAGATACATTG -3′(XhoⅠ)，擴增長度1 523 bp；擴增ori-AmpR的引物：AmpR上游5′-CCGCTCGAGGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATT-3′(XhoⅠ)，AmpR下游5′-CGGGATCCTGTGCGCGGAACCCCTATTTGT-3′(BamH Ⅰ)，擴增產(chǎn)物擴增長度1 939 bp；擴增左側(cè)同源臂的引物：左臂上游：5′-GAAGATCTGGGCAGGCACAGTGGGGGGTTA-3′ (BglⅡ)，左臂下游：5′-CGGGATCCCTGCTGCATGGCACCCAGCC-3′(BamH Ⅰ)，擴增長度約620 bp；擴增右側(cè)同源臂的引物：右臂上游：5′-CCGCTCGAGATCTTCTGGGTAGACAGCAGTGCCAC-3′(XhoⅠ)，右臂下游：5′-CCGCTCGAGAACTCTCTTTGAGGGCGTGTGCG-3′ (XhoⅠ)，擴增長度約570 bp；5′ Joinction PCR引物：左臂前-NeoR上游：5′-TGGGAAAGTAATGGGAACCGAGA-3′，左臂前-NeoR下游：5′-GCGGAGAATGGGCGGAACTG-3′，擴增長度1 244 bp；3′ Joinction PCR引物：NeoR-右臂后上游：5′-GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATG-3′，NeoR-右臂后下游：5′-GGCAACCCCCAACCATAAAATGA-3′，擴增長度1 025 bp；構(gòu)建表達gRNA(針對FasL)載體所用寡核苷酸：5′-ACCGCTGGGGACATGGGTAATTCA-3′，5′-AAACTGAATTACCCATGTCCCCAG-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR 50 μL體系的模板用量：質(zhì)粒為100 ng，基因組DNA為1.5 μg。

各片段的擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；退火溫度因片段不同而異，時間均為30 s；延伸72 ℃，時間設(shè)定根據(jù)是pfu每分鐘擴增500 bp，普通Taq每分鐘擴增1 kb；72 ℃再延伸5 min。擴增NeoR、ori-AmpR、左側(cè)同源臂、右側(cè)同源臂、5′Joinction和3′Joinction的退火溫度分別是：61，61，60，60，61，57 ℃。循環(huán)數(shù)一般為30，5′Joinction和3′ Joinction PCR的循環(huán)數(shù)為35。以上PCR反應(yīng)除Joinction PCR使用的是普通Taq，其他均使用pfu。

菌落PCR：直接挑取少量菌落加入PCR體系作為模板，使用普通Taq擴增。

擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s；72 ℃再延伸5 min；循環(huán)數(shù)一般為30。

1.2.2 酶切與連接XhoⅠ單酶切或其參與的雙酶切均過夜。BamH Ⅰ和BglⅡ酶切時間不少于3 h。

15 μL 連接體系中外源片段和載體按摩爾比約為7∶1，DNA總用量為150～200 ng，16 ℃過夜。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 B16細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。

進行基因編輯時，pST-Cas9、pGL3-U6 sgRNA和本試驗構(gòu)建的同源重組載體pAmpR-NeoR-FasL(或pAmpR-NeoR)按照摩爾比1∶4∶1轉(zhuǎn)染，六孔板每孔質(zhì)?？傆昧考s5 μg，轉(zhuǎn)染后48 h使用G418篩選(工作濃度1 mg/mL)，每2 d換液，14 d后收獲細胞混合克隆，提取基因組。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源重組載體pAmpR-NeoR的構(gòu)建

構(gòu)建同源重組載體pAmpR-NeoR的總體思路是：利用真核表達載體pcDNA3.1(+)-HA-His的抗氨芐青霉素基因Ampicillin(以下簡稱AmpR)、原核復(fù)制原點pUCori(以下簡稱ori)和抗新霉素基因Neomycin(包括其前后的SV40啟動子和加尾信號，以下簡稱NeoR)分別作為目的載體的原核選擇標記、復(fù)制原點和真核篩選基因。為了在正選擇標記NeoR兩側(cè)引入克隆位點，用于左、右同源臂的克隆，分別擴增AmpR-ori片段和NeoR片段，通過引物在PCR產(chǎn)物兩端引入酶切位點，當(dāng)擴增片段連接到目的載體后，NeoR兩端就具備了克隆位點。構(gòu)建流程如圖1-A示意。

A.構(gòu)建流程的示意圖；B.PCR擴增得到的AmpR-ori和NeoR，條帶位置正確；M.DL2000 Marker；C.連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞得到若干轉(zhuǎn)化子，挑選其中4個，提取其質(zhì)粒，質(zhì)粒以BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，鑒定重組子，M.DL2000 Marker。

A.The schematic diagram of the vector construction process；B.AmpR-oriandNeoRobtained by PCR amplification were seperated by agarose gel electropherosis，and the corresponding bands were in the right position,Marker was DL2000；C.The plasmids extracted from four transformants were cleavaged withBamH Ⅰ andXhoⅠ to identify recombinant,Marker was DL2000.

圖1pAmpR-NeoR的構(gòu)建
Fig.1TheconstructionofpAmpR-NeoR

首先，以pcDNA3.1(+)-HA-His為模板，分別擴增其上的AmpR-ori和NeoR；PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化，完成Buffer轉(zhuǎn)換，然后均以BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切；酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，由圖1-B可見，目的條帶位置正確(約1 940，1 530 bp)，切膠回收目的條帶。

接下來，將回收的酶切產(chǎn)物連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，有正常菌落生成，表明轉(zhuǎn)入其中的AmpR-ori為環(huán)狀分子或環(huán)狀分子的一部分，而且仍能正常發(fā)揮作用，ori使轉(zhuǎn)入的環(huán)狀分子可以復(fù)制，AmpR賦予細菌氨芐抗性，符合目的載體的要求。挑選了4個轉(zhuǎn)化子，提取其質(zhì)粒，質(zhì)粒以BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，進行重組子鑒定。結(jié)果如圖1-C所示，酶切產(chǎn)生2個片段，大小符合預(yù)期(約1 940，1 530 bp)，所以4個轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入的均是正確的重組子，選取1號重組子，記作pAmpR-NeoR，進行后續(xù)試驗。

2.2 pAmpR-NeoR-FasL的構(gòu)建

為檢測pAmpR-NeoR是否能夠用于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，選取小鼠FasL基因的第一個外顯子中一段序列作為待編輯位點，構(gòu)建了針對這一靶位點的同源重組載體pAmpR-NeoR-FasL，構(gòu)建流程示意如圖2-A。首先，以XhoⅠ酶切pAmpR-NeoR，酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化，然后去磷酸化，再以瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段大小符合預(yù)期(約3 500 bp)，切膠回收(圖2-B)。接下來，以B16細胞基因組為模板，PCR擴增緊鄰靶位點下游長度約570 bp的片段，作為右側(cè)同源臂(以下簡稱右臂)；PCR產(chǎn)物純化后用XhoⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶位置正確，切膠回收目的條帶(圖2-C右側(cè)泳道)。

A.構(gòu)建流程的示意圖；B～E.pAmpR-NeoR-FasL(R)的構(gòu)建：B.XhoⅠ酶切得到線性pAmpR-NeoR，條帶位置正確；Marker為DL15000；C.擴增得到左、右同源臂，條帶位置正確，Marker為DL2000；D.菌落PCR鑒定重組子右側(cè)同源臂的方向，Marker為DL15000，N為陰性對照，即以水作為PCR模板；E.BamH Ⅰ酶切鑒定右臂方向正確的重組子大小，Marker為DL15000；F～H.pAmpR-NeoR-FasL的構(gòu)建：F.BamH Ⅰ酶切得到線性化的pAmpR-NeoR-FasL(R)，條帶位置正確，Marker為DL15000；G.菌落PCR鑒定重組子左側(cè)同源臂的方向，Marker為DL15000，N為陰性對照，即以水作為PCR模板；H.BamH Ⅰ 酶切鑒定左臂方向正確的重組子的大小，Marker為DL15000。

A.The schematic diagram of the vector construction process；B-E.The construction of pAmpR-NeoR-FasL(R)：B.Linear pAmpR-NeoRobtained byXhoⅠ digestion was seperated by agarose gel electropherosis，and the corresponding bands was in the right position,Marker was DL15000；C.Amplification products of left and right homologous arms were in the correct band position，Marker was DL2000；D.The direction of the right homologous arm of the recombinants was identified with colony PCR，Marker was DL15000，N was negative control (ddH2O) for PCR template；E.The size of the recombinant with right arm in correct direction was verified byBamH Ⅰ digestion,Marker was DL15000；F-H.The construction of pAmpR-NeoR-FasL:F.The position of Linear plasmid pAmpR-NeoR-FasL(R) cut byBamH Ⅰ was correct,Marker was DL15000；G.The direction of the left arm of the recombinants was identified with colony PCR,Marker was DL15000.N was negative control (ddH2O) for PCR template;H.The size of the recombinant with left arm in correct direction was verified byBamH Ⅰ digestion，Marker was DL15000.

圖2pAmpR-NeoR-FasL的構(gòu)建
Fig.2TheconstructionofpAmpR-NeoR-FasL

將回收的線性化空載體與右臂連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，挑選6個轉(zhuǎn)化子，鑒定重組子。由于右臂克隆至載體采用的是插入型，所以要鑒定重組子中右臂的方向。使用NeoR上游和右臂下游這對引物進行菌落PCR，如果方向正確，會擴增得到長度約2 090 bp的產(chǎn)物，若方向不正確，則無擴增產(chǎn)物。結(jié)果顯示，1號重組子正確(圖2-D)；進一步使用BamH Ⅰ酶切該重組子，得到長度約為4 030 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期吻合(圖2-E)，這樣，得到含有方向正確的右臂重組載體，記作pAmpR-NeoR-FasL(R)。

接下來，以BamH Ⅰ 酶切pAmpR-NeoR-FasL(R)，酶切產(chǎn)物純化、磷酸化和凝膠電泳步驟同上，條帶位置正確，切膠回收(圖2-F)。同時，以B16細胞基因組為模板，PCR擴增緊鄰靶位點上游長度約620 bp的片段，作為左側(cè)同源臂(以下簡稱左臂)，純化的PCR產(chǎn)物用BglⅡ和BamH Ⅰ 酶切、電泳，目的條帶位置正確，切膠回收目的條帶(圖2-C左側(cè)泳道)。

連接回收的線性載體和左臂，轉(zhuǎn)化細菌，挑選8個轉(zhuǎn)化子。使用左臂上游和NeoR下游這對引物進行菌落PCR，鑒定左臂方向正確的重組子。如果方向正確，會擴增得到長度約2 140 bp的產(chǎn)物，若方向不正確，則無法擴增。結(jié)果顯示，8號重組子正確(圖2-G)；進一步使用BamH Ⅰ酶切這個重組子，得到長度約為4 650 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期吻合(圖2-H)。這樣，得到含有方向正確的左、右臂的重組載體，記作pAmpR-NeoR-FasL。

2.3 pAmpR-NeoR-FasL指導(dǎo)編輯

接下來，對pAmpR-NeoR-FasL指導(dǎo)基因編輯的能力進行檢測。如果可以指導(dǎo)編輯，同源重組載體上位于左右同源臂之間的NeoR基因就有機會整合進靶序列。設(shè)計了針對靶序列的Oligo，按照Su等[22]的方法，構(gòu)建pGL3-U6 sgRNA-FasL(圖1)。把pST-Cas9、pGL3-U6 sgRNA-FasL與pAmpR-NeoR-FasL(或空載體pAmpR-NeoR)共轉(zhuǎn)染B16細胞，經(jīng)過G418篩選14 d后，提取基因組，采用Junction PCR方法檢測基因編輯情況。圖3-A、B顯示，5′和3′Junction PCR產(chǎn)物長度符合預(yù)期，提示NeoR基因插入位點正確；對Junction PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果進一步肯定NeoR基因確實定點整合進靶序列(圖3-C)。這表明，構(gòu)建的pAmpR-NeoR可以作為同源重組載體，通過將靶位點上下游序列克隆至載體的NeoR基因兩側(cè)，可以按研究人員意志將NeoR基因整合進靶位點，實現(xiàn)編輯。

使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和同源重組載體轉(zhuǎn)染B16細胞，經(jīng)過14 d篩選得到混合克隆，提取其基因組DNA，分別進行：A.5′Junction PCR；B.3′Junction PCR，PCR產(chǎn)物長度均符合預(yù)期(1 244 bp和1 025 bp)；V.空載體pAmpR-NeoR；F.供體質(zhì)粒pAmpR-NeoR-FasL；M.Marker DL 2000；C.Junction PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，進一步肯定NeoR基因確實定點整合進靶位點。

B16 cells transfected with CRISPR/Cas9 system and homologous recombinant vectors were screened for 14 days.The genomes DNA of the stable pool were extracted for the next experiment:A.5′Junction PCR;B.3′Junction PCR，and the sizes of these PCR products are as expected 1 244 bp and 1 025 bp，respectively;V.The empty vector pAmpR-NeoR;F.The donor plasmid pAmpR-NeoR-FasL;M.DL2000 Marker;C.The results of the sequencing of the Junction PCR products further confirmed thatNeoRgene was indeed integrated into the target site.

圖3pAmpR-NeoR-FasL可以指導(dǎo)基因編輯
Fig.3pAmpR-NeoR-FasLcouldguidegeneediting

3 討論

在試驗中成功構(gòu)建了一個相對簡易但有效的同源重組空載體pAmpR-NeoR，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的供體質(zhì)粒pAmpR-NeoR-FasL可以準確地將目的序列NeoR整合進靶序列。相對于一般的同源重組載體，pAmpR-NeoR只有正選擇標記，而沒有供排除隨機整合的負選擇標記，所以，只是在混合克隆水平對其進行了功能的驗證。如果挑選發(fā)生編輯的單克隆，使用該載體比使用具有正負篩選標記的供體質(zhì)粒工作量要大。所以，該載體只能適合于對于功能進行初步鑒定等試驗使用。正是考慮到這一點，在構(gòu)建空載體時，在克隆位點的選擇上采用了BamH Ⅰ和XhoⅠ這2個酶的酶切位點。

BamH Ⅰ與BglⅡ是同尾酶，XhoⅠ與SalⅠ是同尾酶，以BamH Ⅰ和XhoⅠ作為克隆位點，這使得pAmpR-NeoR有3個優(yōu)點。一是基本能保證載體對于靶序列的通用性。因為同源臂長度在700 bp左右，在這樣長度的序列中，左臂同時具有BamH Ⅰ和BglⅡ的幾率極低，同樣右臂同時具有XhoⅠ和SalⅠ的幾率也極低，因而pAmpR-NeoR幾乎可用來構(gòu)建針對任何序列的供體質(zhì)粒。二是保證了pAmpR-NeoR具有良好的擴展性。本試驗中，左臂5′端使用了BglⅡ位點，與線性化載體的BamH Ⅰ位點連接之后形成焊死位點；而3′端使用了BamH Ⅰ，與載體的BamH Ⅰ位點連接之后仍然形成BamH Ⅰ位點，這個BamH Ⅰ位點可用作綠色熒光蛋白(EGFP)基因克隆，而EGFP基因可作為便于鏡下觀察的正選擇標記。同樣，如果右臂5′端采用SalⅠ與載體上的NeoR基因3′端焊死，3′端采用XhoⅠ，連接載體之后仍形成XhoⅠ位點，便可用作負選擇標記的基因克隆。三是保證了pAmpR-NeoR使用的靈活性，這其實是上述2個優(yōu)點的綜合體現(xiàn)。比如，若右臂具有XhoⅠ或SalⅠ，負選擇基因則無法在其下游克隆，則可以克隆在左臂上游。當(dāng)然這需要將左臂的3′端與NeoR的5′端焊死，5′端仍與載體形成BamH Ⅰ位點。

綜上所述，構(gòu)建的pAmpR-NeoR對于功能初步鑒定等試驗具有一定的應(yīng)用價值，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在該載體具有序列通用性、良好的擴展性和靈活性，便于根據(jù)需要進一步改造，以滿足具體試驗的不同要求。

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