任青青，錢偉東

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是急性腦梗死重要的病理基礎(chǔ)，而免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生的重要原因[1]。其中，輔助性T細胞17（T helper 17 cells，Th17）是最新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，主要通過分泌多種促炎癥因子及輔助因子參與AS的病理進程[2-3]。目前，有關(guān)Th17在大動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病機制中的作用研究仍較少。頸動脈內(nèi)-中膜厚度（intimamedia thickness，IMT）是監(jiān)測全身動脈粥樣硬化程度的重要指標，可反映頸動脈的硬化程度[4]。本研究旨在通過檢測患者外周血Th17比例及頸動脈IMT，分析Th17比例與大動脈粥樣硬化性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度、IMT的相關(guān)性，探討Th17在大動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病機制中的作用及其與腦梗死病程發(fā)展的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年10月-2016年5月就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的首次發(fā)病的大動脈粥樣硬化性腦梗死患者為研究組，同期健康體檢者（頸彩色多普勒超聲檢查排除頸動脈粥樣硬化）為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

研究組納入標準：①成年患者；②首次發(fā)病，且發(fā)病時間在12 h內(nèi)；③前循環(huán)腦梗死，經(jīng)頸彩色多普勒超聲檢查明確患者有頸動脈粥樣硬化，并且所有患者均符合動脈粥樣硬化性腦梗死診斷標準[5]。

排除標準：①既往有腦血管病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、嚴重心臟、肝臟、腎臟等疾病病史；②近3周服用過免疫抑制劑或抗炎藥；③近4周有感染性疾病。

采集所有研究對象的臨床資料，包括年齡、性別等一般資料，及高血壓病[6]、糖尿病[7]、高脂血癥[8]，以及外周血Th17細胞占CD4+T細胞比例。對所有入組者均進行頸部經(jīng)顱彩色多普勒檢查，采集頸動脈IMT。

1.2 研究組亞組 根據(jù)入院時美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分將腦梗死患者分為輕型組（≤15分）、中型組（16～30分）和重型組（31分以上）[9]。采用經(jīng)頸彩色多普勒超聲檢查患者頸動脈IMT，IMT＜1.00 mm且內(nèi)膜光滑為正常；1.0 mm≤IMT＜1.3 mm為內(nèi)膜增厚；IMT≥1.3 mm且增厚的內(nèi)膜向管腔內(nèi)凸出為斑塊形成[10]。

1.3 外周血Th17檢測 所有研究對象采集空腹外周肘靜脈血5 ml，在流式試管內(nèi)加入全血和洛斯維公園紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)液200 μl混勻，同時加入細胞刺激液（500）2 μl、莫能霉素溶液（1000）1 μl置于37℃、5%CO2刺激培養(yǎng)5 h；取200 μl培養(yǎng)后全血細胞并加入異硫氰酸熒光素-CD3抗體5 μl、藻青蛋白-CD8a抗體2 μl，室溫避光孵育20 min；加入稀釋后溶血素，室溫避光孵育10 min；1500 r/min離心5 min，去上清液且磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次；加入50 μl固定劑避光15 min，加入PBS洗滌1次，加入破膜劑50 μl，同時加入藻紅蛋白-白介素17抗體5 μl，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次；進行同型對照分析。使用流式細胞儀檢測Th17占CD4+T細胞比例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPASS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較用χ2檢驗。相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 研究組45例，平均年齡（65.1±9.9）歲，對照組32例，平均年齡（62.1±10.2）歲，兩組性別、年齡、高血壓病、糖尿病、高脂血癥比例差異無顯著性（表1）。

2.2 外周血Th17比例結(jié)果 研究組較對照組外周血Th17比例顯著增加[（7.41±1.93）%vs（2.8±0.64）%，P＜0.001）]。根據(jù)NIHSS評分，研究組中輕型組7例、中型組19例、重型組19例。輕、中、重型組患者Th17比例分別為（4.97±0.89）%、（7.06±1.33）%及（8.65±1.71）%。這3組與對照組的Th17比例比較有整體差異（F=105.989，P＜0.001）。進一步兩兩比較顯示研究組中的輕、中和重度亞組Th17比例均顯著高于對照組（P均＜0.001），且中型組高于輕型組（P=0.003）、重型組高于中型組（P=0.002）和輕型組（P=0.002）。

表1 研究組和對照組一般資料比較

表2 研究組外周血Th17細胞與患者年齡、性別等因素的關(guān)系

2.3 研究組外周血Th17比例與患者年齡、性別等因素的關(guān)系 對不同年齡、性別，是否伴有高血壓、糖尿病、高血脂等進行外周血Th17比例進行比較，顯示均無顯著性差異（表2）。

2.4 IMT與Th17相關(guān)性分析 研究組的IMT平均值為（1.49±0.35）mm，相關(guān)分析結(jié)果顯示，研究組IMT與Th17比例呈正相關(guān)（r＝0.68，P＜0.001）。

3 討論

AS是一種常見的動脈硬化型血管病，目前，關(guān)于AS的發(fā)病機制主要有脂質(zhì)浸潤學(xué)說、炎癥損害學(xué)說和內(nèi)皮損傷學(xué)說等[11-12]。這些學(xué)說的共同點是都認為炎癥免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[13]。其中，有研究認為T淋巴細胞及其分泌的細胞因子組成的炎癥介質(zhì)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。

Th17細胞是一種具有獨立分化機制及促進免疫炎性反應(yīng)功能的CD4+T細胞亞群，主要特征是分泌炎性因子白細胞介素（interleukin，IL）-17[15]。研究認為，IL-17可通過誘導(dǎo)多種細胞釋放中性粒細胞趨化因子及促炎性因子、招募激活中性粒細胞來調(diào)整局部組織炎癥反應(yīng)[16]。Th17細胞比例及IL-17表達量升高將導(dǎo)致機體免疫平衡受到破壞[17]。Th17細胞在動脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病中具有重要意義。Wang等[18]通過對外周血的研究發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動脈綜合征患者外周血Th17細胞及IL-17表達水平較健康對照組均有顯著增加。Gao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠動脈血管壁的Th17細胞及IL-17水平比對照組顯著升高，且Th17細胞增加的程度與頸動脈斑塊大小呈正相關(guān)，而阻斷IL-17發(fā)揮作用后可以延緩頸動脈斑塊的發(fā)展。目前關(guān)于Th17細胞在AS性腦梗死患者外周血中的變化及與其頸動脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，AS性腦梗死患者外周血Th17細胞比例較健康體檢者顯著增加，提示Th17細胞占CD4+T細胞比例增加可能是動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的重要免疫機制之一。本研究中AS性腦梗死患者外周血Th17細胞比例與患者發(fā)病影響因素如年齡、性別、高血壓病、糖尿病及高脂血癥均無明顯關(guān)系。然而，有研究認為Th17細胞與高血壓病、糖尿病及高脂血癥均有正相關(guān)關(guān)系[20-22]。本研究結(jié)果與上述研究不同，考慮可能是與各個研究的入組標準不一致有關(guān)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，Th17比例與患者神經(jīng)功能缺損評分有關(guān)，隨著神經(jīng)功能缺損的逐漸加重，研究組外周血Th17細胞比例逐漸增加，且與頸動脈IMT呈正相關(guān)，提示外周血Th17細胞可能與AS性腦梗死的進展有關(guān)。

本研究樣本量相對較少，沒有對腦梗死患者連續(xù)入組，且未將IL-17納入研究范圍，我們后期將增加樣本量，并進一步進行其他炎性介質(zhì)與Th17細胞相關(guān)的機制研究。

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【點睛】通過對健康人群和不同嚴重程度的大動脈粥樣硬化性腦梗死患者的對比分析顯示，外周血T淋巴輔助細胞17比例的升高可能參與了動脈粥樣硬化性腦梗死病理過程的發(fā)生和發(fā)展。