張露，崔曉燕，張博愛，3

缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是腦血管病最常見的類型，約占全部腦血管病的三分之二[1]。近年來大量研究表明，血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平增高是缺血性卒中的獨立危險因素[2]。Hcy水平增高可受多種因素影響[3]，其代謝的關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）起關(guān)鍵作用，其中以MTHFR基因C667T堿基突變最常見[4]。MTHFR C667T基因突變是否與IS有關(guān)，目前國內(nèi)外研究結(jié)果尚不一致。本研究采用酶循環(huán)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-基因芯片檢測IS患者和無缺血性腦血管病對照者血漿Hcy水平及MTHFR C667T基因多態(tài)性分型，探討其與IS的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年6月-2016年2月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及神經(jīng)介入科確診為IS的住院患者（IS組），選擇同期無缺血性腦血管病病史，于醫(yī)院其他科室住院患者為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：IS組符合：①1995年第4屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的IS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次卒中，急性期；③經(jīng)頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和（或）電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）檢查確診。對照組要求無心腦血管疾病病史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：IS組排除有出血轉(zhuǎn)化、心源性腦栓塞者；對照組排除任何腦血管疾病、下肢靜脈血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、重度抑郁者等；兩組均排除有惡性腫瘤、器官功能衰竭、肝腎功能異常、甲亢、癲癇等疾病者。

1.2 方法

1.2.1 分組與分析指標(biāo) 按照以上納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，分為IS組和對照組，比較兩組平均年齡和吸煙者、飲酒者、高血壓患者、高血脂患者、糖尿病患者比例構(gòu)成。其中，飲酒定義為近一年每周平均飲酒3次及其以上者；吸煙定義為每日吸煙1支及以上，連續(xù)吸煙1年及以上者[5]。分析兩組MTHFR C667T基因型、血漿Hcy水平的差異及Hcy與血清VitB12、葉酸水平的相關(guān)性。

1.2.2 血漿Hcy水平及血清VitB12、葉酸濃度的檢測 所有患者均于清晨空腹采集外周靜脈血2 ml于乙二胺四乙酸鈉抗凝管中，酶循環(huán)法檢測血漿Hcy水平，免疫分析法檢測血清VitB12和葉酸濃度。

1.2.3 基因型的檢測 用PCR-芯片雜交法檢測MTHFR C667T基因型多態(tài)性，共3種基因型：CC（酶活性高，葉酸轉(zhuǎn)化能力高）、CT（酶活性中，葉酸轉(zhuǎn)化能力中等）、TT（酶活性低，葉酸轉(zhuǎn)化能力低下）（圖1）。

圖 1 MTHFR C667T 3種基因型

1.2.4 血漿Hcy水平與VitB12及葉酸之間的相關(guān)性排除近3個月內(nèi)服用VitB12、葉酸制劑而影響相關(guān)指標(biāo)者。將IS組與對照組分別進行Hcy與VitB12及葉酸水平的相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計處理。符合正態(tài)分布的計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。血漿Hcy水平與VitB12及葉酸之間的相關(guān)性采用Spearman分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。對基因頻率在人群中的分布進行Hardy-Weinberg平衡適合度檢驗。檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，P＞0.05認(rèn)為基因頻率分布差異無顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 研究共納入IS組217例，其中短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）患者15例，缺血性卒中患者202例，年齡36～83歲。對照組納入了223例，年齡40～84歲。IS組平均年齡和吸煙、高血壓病、糖尿病的比例均顯著高于對照組，兩組性別、飲酒者和高脂血癥的比例差異無顯著性（表1）。

2.2 兩組血漿Hcy水平檢測結(jié)果 IS組血漿Hcy水平為（23.95±12.13）μmol/L，顯著高于對照組（17.31±7.20）μmol/L（t=29.61，P＜0.001）。

2.3 Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗 IS組（χ2=0.0170，P=0.918）和對照組（χ2=0.000，P=1.000）基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有人群代表性。

2.4MTHFR C667T基因多態(tài)性及等位基因頻率分布 IS組CC（31例）、CT（97例）、TT（89例）3種基因型分布頻率分別為14.3%、44.7%、41.0%，對照組CC（41例）、CT（109例）、TT（73例）3種基因型分布頻率分別為18.4%、48.9%、32.7%，兩組基因型頻率差異無顯著性（χ2=3.59，P=0.166）。兩組CC+CT與TT基因型分布頻率差異無顯著性（χ2=3.24，P=0.072）。IS組MTHFR基因C、T等位基因頻率分別為36.6%、63.4%，對照組C、T等位基因頻率分別為42.8%、57.2%，差異無顯著性（χ2=3.52，P=0.061）（表2）。

2.5MTHFR C667T基因型多態(tài)性與血漿Hcy濃度的關(guān)系 缺血性卒中患者組CC、CT、TT基因型對應(yīng)的平均血漿Hcy水平分別為（16.65±6.90）μmol/L、（18.21±8.08）μmol/L及（25.19±12.53）μmol/L，差異有顯著性（F=490.49，P＜0.001），其中TT基因型Hcy水平明顯高于CC及CT基因型，CT基因型顯著高于CC基因型（均P＜0.001）。

2.6 血漿Hcy水平與VitB12及葉酸的相關(guān)性分析IS組排除最近服用過含VitB12及葉酸的藥物后共有88例患者，Hcy、VitB12及葉酸水平分別為15.7（12.9，19.54）μmol/L、280.00（217.00，353.00）pmol/L及4.00（3.00，5.10）ng/L，血漿Hcy水平與VitB12和葉酸水平均呈負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.431和-0.507，P均＜0.001）。對照組中排除最近服用過含VitB12及葉酸的藥物后有125例，Hcy、VitB12及葉酸水平分別為15.7（12.9，19.54）μmol/L、320（265.00，447.00）pmol/L、5.4（3.9，7.1）ng/L，血漿Hcy水平與VitB12和葉酸水平均呈負(fù)相關(guān)（rs分別為-0.489和-0.446，均P＜0.001）。

3 討論

Hcy是人體內(nèi)的一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，1969年McCully[6]的研究顯示其為心血管疾病的獨立危險因素。Ashjazadeh等[7]開展的一個病例對照研究顯示，相對正常對照組，矯正傳統(tǒng)危險因素后高Hcy血癥（血漿Hcy＞15 μmol/L）引起卒中的比值比（odds ratio，OR）為2.17[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）1.24～3.79]。本次研究結(jié)果中IS組血漿Hcy水平明顯高于對照組，差異有顯著性，也驗證了該結(jié)論。

研究顯示，Hcy可能通過影響機體凝血、血小板功能、血管平滑肌細(xì)胞反應(yīng)、內(nèi)皮功能等導(dǎo)致動脈血栓形成[8]。Hofmann[9]研究表明，高Hcy血癥可通過增強血管中核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-NB）的活動來調(diào)節(jié)一系列基因的表達，從而破壞機體自我穩(wěn)態(tài)中抗炎和抗血栓機制。通常情況下，Hcy在體內(nèi)有4種代謝途徑，其中一種是Hcy在甲硫氨酸合成酶的作用下，以VitB12為輔助因子，以N5-甲基四氫葉酸為甲基供體生成L-甲硫氨酸，參與甲硫氨酸循環(huán)，最終分解為丙酮酸、硫酸和水，隨尿液排出體外[10]。本研究結(jié)果表明，缺血性卒中和無卒中的對照組Hcy水平與VitB12及葉酸均呈負(fù)相關(guān)，分析其原因可能是體內(nèi)VitB12和葉酸缺乏導(dǎo)致了甲硫氨酸循環(huán)障礙，從而使Hcy在體內(nèi)蓄積。目前，已有研究證實葉酸能效降低血漿Hcy濃度[11]。Zeng等[12]Meta分析亦表明，補充葉酸對葉酸低攝入地區(qū)高Hcy血癥的發(fā)病有輕度預(yù)防作用；而單獨補充VitB12降低血漿Hcy水平效果不明顯，只有同時補充葉酸才能顯著降低血漿Hcy水平。

N5-甲基四氫葉酸在N5-N10-MTHFR的催化下形成，MTHFR基因的突變可降低該酶的活性，引起血漿Hcy水平的增高。流行病學(xué)研究顯示，MTHFR基因（C667T）T等位基因突變可解釋血漿Hcy水平總變異的6%[13]，MTHFR基因多態(tài)性被認(rèn)為是心腦血管疾病危險因素的候選基因[14]。MTHFR基因有多個突變位點，至少有7個位點易發(fā)生C→T突變，位于第四位外顯子C667T位點突變最為常見。有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T雜合子酶活性僅為野生型的30%，可導(dǎo)致純合子血漿Hcy濃度較雜合子及野生型明顯升高[15]。在本研究中，所有患者的TT基因型Hcy平均水平明顯高于CC及CT基因型，CT基因型高于CC基因型，差異均具有顯著性。故推薦血漿Hcy水平異常增高的患者做MTHFR C667T基因型測定，以指導(dǎo)治療。

表1 缺血性卒中組與和對照組一般臨床資料的比較

表2 MTHFR C667T基因型頻率分布

MTHFR C667T基因突變是否是IS的危險因素，目前尚有爭議。Konrad等[16]通過配對的病例對照研究認(rèn)為，MTHFR C667T基因多態(tài)性與IS沒有關(guān)系。馬濤[17]亦得出相同結(jié)論。然而，Harbuzova等[18]和Li等[19]的研究則認(rèn)為MTHFR C667T基因多態(tài)性是IS的危險因素。本次研究結(jié)果顯示，CC、CT、TT三種基因型分布頻率、C、T等位基因頻率在IS組與對照組中的差異不具有顯著性，提示MTHFR C667T基因突變可能不是IS的危險因素，分析原因可能為IS的發(fā)生是遺傳和環(huán)境多種因素相互作用的一個復(fù)雜過程，與傳統(tǒng)的危險因素相比較而言，MTHFR C667T基因的作用可能受到基因與基因的相互作用，轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中的修飾以及蛋白質(zhì)之間的相互作用的影響。Tasdemir等[20]通過檢測599例IS患者和100例正常對照者7種具有促血栓形成危險的候選基因的基因型認(rèn)為，MTHFR C667T基因突變在IS的發(fā)生中不具有重要作用。

綜上所述，這次較大樣本的病例對照研究結(jié)果提示IS患者血漿Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突變、體內(nèi)葉酸與VitB12水平降低均可使Hcy水平升高，但未發(fā)現(xiàn)MTHFR C667T基因突變與IS有關(guān)系。本研究屬于醫(yī)院內(nèi)病例對照研究，可能存在住院選擇偏倚。另有研究認(rèn)為，在基因相關(guān)性研究中，尤其是在進行進一步的亞組分析時，要建立可靠的結(jié)論，每組需要至少1000例樣本量[21]。因此，后續(xù)研究仍需進一步大規(guī)模多中心的隊列研究。

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【點睛】本研究證實了缺血性卒中患者血漿Hcy水平偏高，MTHFR C667T基因突變、葉酸和VitB12水平降低是血漿Hcy水平升高的影響因素，而MTHFR C667T基因突變與缺血性卒中無關(guān)。