趙博，楊彬彬，王佳偉

2006年，Vargas等[1]提出卒中相關(guān)性感染（stroke associated infection，SAI），將其定義為卒中發(fā)病時(shí)無感染且不處于感染潛伏期，卒中發(fā)病后7 d內(nèi)發(fā)生的感染，以肺部感染和泌尿系感染為主[2]，其發(fā)生率為23%～65%，往往會(huì)加重病情并影響預(yù)后[3]。卒中會(huì)打破神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的平衡，誘導(dǎo)產(chǎn)生外周免疫抑制綜合征（stroke induced immunodepression syndrome，SIDS）[4]，主要表現(xiàn)為廣泛的淋巴細(xì)胞凋亡和功能障礙，從而導(dǎo)致感染發(fā)病率增加[5]。T淋巴細(xì)胞在卒中后機(jī)體免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[6-7]，CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制作用，包括調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、限制病變發(fā)展和促進(jìn)組織修復(fù)等[8-9]。卒中后各T淋巴細(xì)胞亞群時(shí)間和空間的分布更有助于闡明他們?cè)谧渲胁±砩磉^程中的作用，然而目前對(duì)于該問題仍存在爭(zhēng)議。本研究通過觀察卒中早期患者外周血中CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞及Tregs動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步揭示卒中急性期免疫變化相關(guān)機(jī)制，以及免疫異常對(duì)于卒中后感染的影響，為發(fā)現(xiàn)新的卒中治療靶點(diǎn)及卒中后感染的預(yù)防和治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年11月-2015年1月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的卒中患者為卒中組。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②發(fā)病24 h內(nèi)入院；③符合2013年由美國心臟學(xué)會(huì)（American Heart Association，AHA）/美國卒中學(xué)會(huì)（American Stroke Association，ASA）的《急性缺血性卒中診治指南》[10]及2010年《自發(fā)性腦出血治療指南》[11]中缺血性卒中和腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實(shí)；④入院當(dāng)天美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分≥3分，且卒中前改良Rankin量表（modi fi ed Rankin Scale，mRS）評(píng)分≤2分。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①痛風(fēng)、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤；②嚴(yán)重肝、腎功能障礙；③急性心肌梗死及其他血管栓塞性疾??；④甲狀腺功能亢進(jìn)及其他慢性消耗性疾?。虎莅l(fā)病前2周內(nèi)有感染史、服用雌激素或2周內(nèi)有外科手術(shù)或外傷。

同期無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征的健康體檢者作為對(duì)照組。

本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 感染診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組 卒中相關(guān)性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷：卒中發(fā)生后胸部影像學(xué)發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)或進(jìn)展性肺部浸潤性病變，同時(shí)合并2個(gè)以上臨床感染癥狀：①發(fā)熱≥38℃；②新出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴胸痛；③肺實(shí)變體征和（或）濕啰音；④外周血白細(xì)胞≥10×109/L或≤4×109/L，伴或不伴核左移。病原學(xué)診斷：患者咳深部痰進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)，同時(shí)排除某些與肺炎臨床表現(xiàn)相近的疾病如肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺間質(zhì)病、肺水腫、肺不張、肺栓塞等[12]。卒中后泌尿系感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)：有發(fā)熱、尿頻、尿急、尿痛、恥骨上區(qū)不適和腰骶部疼痛等癥狀可做出臨床診斷；②尿培養(yǎng)：清潔中段尿培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)女性＞105CFU/ml、男性＞104CFU/ml，或?qū)蚧颊吡羧〉哪驑?biāo)本細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)＞104CFU/ml[13]。

根據(jù)發(fā)病1周內(nèi)有無感染，將患者分為感染組和非感染組。

1.3 主要試劑與儀器 3色淋巴細(xì)胞亞群試劑CD4/CD8/CD3單克隆抗體（單抗）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD4單抗、別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的CD25單抗和同型對(duì)照Mouse γ1、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標(biāo)記的FoxP3單抗和同型對(duì)照IgG2a，以及溶血素、FoxP3固定/破膜/洗液，均購自美國BD公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，分析軟件為Cell Quest Pro系統(tǒng)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 卒中組于發(fā)病24 h內(nèi)、3 d和7 d采取2 ml四乙酸二氨基乙烷（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的外周靜脈血，對(duì)照組于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集2 ml EDTA抗凝的外周靜脈血。標(biāo)本分裝為2份，分別于檢驗(yàn)科檢測(cè)血常規(guī)及在中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群，標(biāo)本均于采集后24 h內(nèi)測(cè)定。

流式細(xì)胞術(shù)操作方法：①CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T細(xì)胞：取抗凝全血100 μl，加入5 μl CD4/8/3單克隆抗體，振蕩器上充分混勻，室溫避光反應(yīng)25 min；加入溶血素1 ml，充分震蕩混勻，室溫避光10 min，1500 r/min離心5 min棄上清液，加1 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗1次棄上清液，加0.5 ml PBS，振蕩器上充分混勻，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。②CD4+CD25+FoxP3+Tregs：取抗凝全血100 μl，實(shí)驗(yàn)組加入CD25-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，對(duì)照組加入IgG1-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，振蕩器上充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；加入FoxP3固定/破膜液1 ml，充分震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，加入FoxP3破膜洗液1 ml，1500 r/min離心5 min洗兩次，棄上清液；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別加FoxP3-PE 5 μl、IgG2-PE 0.5 μl，充分震蕩混勻，室溫避光孵育2 h，加0.5 ml PBS，振蕩器上充分混勻，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)算：血常規(guī)測(cè)得淋巴細(xì)胞絕對(duì)值×流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得相應(yīng)細(xì)胞比例；CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)算：血常規(guī)測(cè)得淋巴細(xì)胞絕對(duì)值×流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例×CD4+CD25+FoxP3+Tregs比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以表示，卒中組與對(duì)照組樣本間采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，非感染組與感染組采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 研究期間連續(xù)入組32例卒中患者（缺血性卒中24例，腦出血8例）。所有患者均于發(fā)病24 h內(nèi)就診，缺血性卒中患者中有2例在癥狀出現(xiàn)4.5 h內(nèi)接受了重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）靜脈溶栓治療。卒中后非感染組24例（缺血性卒中19例，腦出血5例），卒中后感染者8例（缺血性卒中5例，腦出血3例）。感染分別發(fā)生在發(fā)病后2 d至4 d，其中2例有明確的病原學(xué)結(jié)果，且均為痰培養(yǎng)草綠色鏈球菌陽性。對(duì)照組23例，卒中組與對(duì)照組年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高脂血癥、心房顫動(dòng)史等方面無顯著差異，但卒中組高血壓病史、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病史、卒中病史及感染發(fā)生率均顯著高于對(duì)照組（表1）。

表1 卒中組與健康對(duì)照組樣本資料統(tǒng)計(jì)

2.2 健康對(duì)照組與卒中后非感染組及卒中后感染組各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值比較 健康對(duì)照組CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值分別為（1.25±0.43）×109/L、（0.67±0.24）×109/L和（0.59±0.28）×109/L，CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值為（0.05±0.03）×109/L。與健康對(duì)照組比較，卒中后非感染組CD3+CD4+T細(xì)胞與Tregs于發(fā)病后7 d升高（P分別為0.02和0.03）；CD3+CD8+T細(xì)胞在發(fā)病后24 h及3 d下降（P分別為0.01和0.03），發(fā)病后7 d升至與健康對(duì)照組無顯著差異。卒中后感染組CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞及Tregs在發(fā)病24 h內(nèi)（P分別為＜0.001，＜0.001，0.03和＜0.001）、3 d（P均＜0.001）、7 d均較健康對(duì)照組明顯下降（P分別為＜0.001，0.01，0.01和0.01）（表2）。

表2 卒中后非感染組及卒中后感染組各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值檢測(cè)結(jié)果及比較（×109/L）

2.3 卒中后非感染組與卒中后感染組各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值比較 卒中后感染組CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞及Tregs在發(fā)病后24 h內(nèi)（P分別為0.01，＜0.001和＜0.001）、3 d（P分別＜0.001，＜0.001和0.04）、7 d（P均＜0.001）均顯著低于卒中后非感染組；兩組CD3+CD8+T細(xì)胞在發(fā)病后24 h內(nèi)無明顯差異，但3 d（P＜0.001）、7 d（P=0.02）卒中后感染組顯著低于卒中后非感染組（表2）。

3 討論

卒中是一個(gè)復(fù)雜的全身炎癥性疾病及自身免疫過程，其發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)多種免疫細(xì)胞和炎癥因子相關(guān)，而卒中同樣會(huì)影響機(jī)體的免疫功能。目前認(rèn)為SIDS實(shí)質(zhì)為神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，卒中后下丘腦-垂體-腎上腺軸被激活，交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng)，腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加，交感神經(jīng)末梢釋放兒茶酚胺類激素增多，從而致外周血、肝臟、脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)下降及功能降低[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，壞死腦細(xì)胞中釋放的高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）可直接誘發(fā)一系列免疫抑制，包括淋巴細(xì)胞減少癥[15]。

目前，關(guān)于卒中后各T淋巴細(xì)胞亞群時(shí)間和空間的動(dòng)態(tài)變化仍存在爭(zhēng)議。Vogelgesang等[16]發(fā)現(xiàn)，腦梗死后外周血C D3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞在發(fā)病當(dāng)天即下降，之后逐漸上升，于發(fā)病后14 d恢復(fù)至與健康對(duì)照組無差異，SAI患者各T淋巴細(xì)胞亞群下降較非SAI患者下降更為明顯。Urra等[17]發(fā)現(xiàn)卒中后外周血CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞及Tregs細(xì)胞發(fā)病后當(dāng)天開始下降，第二天降至最低，后逐漸回升；肺部感染者各細(xì)胞數(shù)明顯低于非感染者。國內(nèi)臨床研究發(fā)現(xiàn)，于入院后24～48 h抽取急性腦梗死患者外周靜脈血，SAI組、非SAI組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞水平均低于健康對(duì)照組，CD8+T淋巴細(xì)胞水平均高于健康對(duì)照組，且SAI組較非SAI組預(yù)后不良[18]。T淋巴細(xì)胞減少可能作為卒中后感染的一個(gè)預(yù)測(cè)因素[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，卒中后非感染者發(fā)病后24 h內(nèi)即出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能下降，至發(fā)病后7 d免疫功能有所恢復(fù)，但Tregs在發(fā)病后7 d開始增多，發(fā)揮其免疫抑制作用。卒中后感染者在發(fā)病后24 h內(nèi)、3 d及7 d細(xì)胞免疫功能明顯低于非感染者，且T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少早于感染發(fā)生時(shí)，故推測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降會(huì)增加感染風(fēng)險(xiǎn)。卒中后感染者在發(fā)病后3 d細(xì)胞免疫功能下降最明顯，Tregs的免疫抑制作用可能是其重要原因之一。此外，國內(nèi)關(guān)于感染后機(jī)體免疫功能的研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染患者外周血CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞低于健康對(duì)照組，而CD3+CD8+T細(xì)胞高于健康對(duì)照組[20]。提示感染對(duì)于機(jī)體免疫狀態(tài)的影響不容小覷，推測(cè)其在卒中后患者感染發(fā)生后的T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化中起重要作用。但目前尚缺乏觀察感染后機(jī)體免疫功能動(dòng)態(tài)變化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

導(dǎo)致本研究與既往研究結(jié)果不完全一致的原因考慮有：樣本量（尤其卒中后感染患者）相對(duì)較少、患者病情嚴(yán)重程度差異較大、發(fā)病危險(xiǎn)因素不同、缺血性卒中及腦出血同時(shí)納入、治療藥物對(duì)免疫功能影響、觀察時(shí)間點(diǎn)不同等。進(jìn)一步的研究需擴(kuò)大樣本量，根據(jù)患者病情輕重程度分組，延長指標(biāo)監(jiān)測(cè)時(shí)間，納入不合并腦血管病的單純感染患者組等，進(jìn)一步明確卒中后機(jī)體免疫功能變化及其與卒中相關(guān)性感染的因果關(guān)系，進(jìn)而闡明相關(guān)病理生理機(jī)制，為卒中后感染的預(yù)防和治療提供理論支持。

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【點(diǎn)睛】本研究對(duì)比了卒中急性期患者在發(fā)生感染及無感染兩種情況下與健康人群外周血T淋巴細(xì)胞亞群的差異，顯示了T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)值在卒中急性期及卒中后感染過程中呈動(dòng)態(tài)變化過程。