管純一，馬旭，夏紅飛

(1. 國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730)

妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)發(fā)病率逐年上升，已成為威脅母嬰健康的重要疾病之一[1]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，患有GDM的孕婦，孕中期羊水中胰島素水平升高，圍生兒易發(fā)高胰島素血癥，高濃度胰島素會(huì)增加新生兒肥胖和糖尿病的發(fā)生幾率[2]。隨著社會(huì)發(fā)展，我國(guó)的飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了巨大變化，肥胖人群日益增加，胎盤(pán)作為重要的營(yíng)養(yǎng)器官，如其暴露在高脂環(huán)境發(fā)生胰島素抵抗，會(huì)造成胎盤(pán)內(nèi)環(huán)境中糖類代謝和激素的變化，進(jìn)而對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。但胎盤(pán)來(lái)源的細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生胰島素抵抗尚不十分清楚，因而研究胎盤(pán)細(xì)胞是否發(fā)生胰島素抵抗，對(duì)闡明GDM的發(fā)生機(jī)制及胎兒異常發(fā)育的原因十分必要。棕櫚酸是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸，能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞等發(fā)生胰島素抵抗[3-5]，被認(rèn)為是胰島β細(xì)胞脂毒性的主要分子，目前廣泛地應(yīng)用于糖脂毒性研究[6]，故選為構(gòu)建胰島素抵抗模型的誘導(dǎo)因子。因?yàn)橐葝u素抵抗的臨床研究有極大的局限性，本實(shí)驗(yàn)選用人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過(guò)建立穩(wěn)定的由棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，為今后GMD的分子機(jī)制研究提供了有效的體外細(xì)胞研究模型。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1. 人胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(HTR8-S/Vneo)：由加拿大Graham等人建立，使用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%血清)培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，1/2傳代繼續(xù)培養(yǎng)；1/2種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 棕櫚酸(Sigma，美國(guó)，P5585-25G)0.027 g溶于0.1 N NaOH 1 ml，70℃水浴，配得1 nmol/L母液。

3. 胰島素(Sigma，美國(guó)，I4011-50MG)蒸餾水配成10 mmol/L母液，1：100稀釋使用。

4. 蒽酮(Sigma，美國(guó)，319899-25G)0.05 g蒽酮溶于25 ml 98%濃硫酸，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞處理和細(xì)胞增殖檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、棕櫚酸組和胰島素組。將HTR8-S/Vneo細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到孔板面積的80%時(shí)，棕櫚酸組加入不同濃度的棕櫚酸處理(0.125、0.25、0.5、0.8、1.0 mmol/L)，胰島素組加入不同濃度的胰島素處理(20、40、60、80、100 nmol/L)，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。稀釋5 mg/ml的MTT(sigma，美國(guó)，M2128-100MG)母液至0.5 mg/ml，加入96孔板，避光2 h后棄液，加入200 μl二甲基亞砜(Sigma，美國(guó)，D2650-100 ml)用酶標(biāo)儀(Bioteck，美國(guó)，Gen5，=562 nm)檢測(cè)吸光度(OD)，取3孔的OD平均數(shù)值。

2. 細(xì)胞葡萄糖攝取量和消耗量檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、胰島素組、棕櫚酸組和棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組。將HTR8-S/Vneo細(xì)胞接種至12孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到孔板面積的80%時(shí)，棕櫚酸組和棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組加入0.125 mmol/L棕櫚酸，培養(yǎng)24 h后，胰島素組加入100 nmol/L胰島素，棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組同時(shí)加入0.125 mmol/L棕櫚酸和100 nmol/L胰島素，分別培養(yǎng)12、18、24、36 h，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒(Sigma，美國(guó)，GAGO20-1KT)檢測(cè)12、18、24、36 h時(shí)培養(yǎng)基的葡萄糖濃度。使用酶標(biāo)儀(Bioteck，美國(guó)，Gen5，=540 nm)檢測(cè)吸光度(OD)，葡萄糖濃度(mg)=(OD值×0.05)/0.05標(biāo)準(zhǔn)品OD值，重復(fù)3次。葡萄糖消耗量=培養(yǎng)基葡萄糖含量-所測(cè)葡萄糖濃度。

3. 細(xì)胞內(nèi)總糖量的檢測(cè)：收集葡萄糖攝取量實(shí)驗(yàn)中12孔板內(nèi)細(xì)胞，使用蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總糖量。用PBS清洗3遍孔板，胰酶消化細(xì)胞，800 r/min離心3 min，棄液，加60 μl堿溶液，取30 μl用BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，沸水浴20 min，冷卻至室溫，每管加入0.5 ml蒽酮，沸水浴5 min，冷卻至室溫后取200 μl加入96孔板，用酶標(biāo)儀(Bioteck，美國(guó)，Gen5，=630 nm)檢測(cè)吸光度(OD)，重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得數(shù)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、棕櫚酸對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞活性的影響

通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸濃度在0.25～1.0 mmol/L時(shí)，棕櫚酸組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而棕櫚酸濃度為0.125 mmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，證明該濃度下棕櫚酸對(duì)細(xì)胞活性影響較小，0.125 mmol/L可作為最適棕櫚酸處理濃度(圖1)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 不同濃度棕櫚酸對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞的增殖作用

二、胰島素對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞活性的影響

通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胰島素濃度在0～60 nmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而胰島素濃度為100 nmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，較為接近對(duì)照組，證明該濃度下胰島素對(duì)細(xì)胞活性影響較小，100 nmol/L可作為最適處理濃度(圖2)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖2 不同濃度胰島素對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞的增殖作用

三、0.125 mmol/L棕櫚酸對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

葡萄糖檢測(cè)試劑盒(GO)分析細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度和葡萄糖的消耗量(圖3和圖4)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，胰島素處理后，細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量有下降趨勢(shì)，葡萄糖的消耗量有增加的趨勢(shì)，尤其在12 h和18 h，存在顯著性差異(P<0.01)；棕櫚酸處理對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度和葡萄糖的消耗量沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。胰島素刺激后棕櫚酸處理，與單獨(dú)胰島素刺激相比，能在24 h(P<0.001)和36 h(P<0.05)顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度和降低葡萄糖的消耗量。

相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間HTR8-S/Vneo細(xì)胞上清液中葡萄糖含量

相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間HTR8-S/Vneo細(xì)胞葡萄糖的消耗量

四、棕櫚酸對(duì)HTR8-S/Vneo細(xì)胞總糖量的影響

用蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總糖含量發(fā)現(xiàn)(圖5)，與對(duì)照組相比，胰島素處理18 h(P<0.05)、24 h(P<0.001)和36 h(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)的總糖量顯著增加。不同時(shí)間段棕櫚酸組與對(duì)照組相比，總糖量沒(méi)有顯著性變化。與單獨(dú)棕櫚酸組相比，在12 h和18 h時(shí)，棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組顯著降低細(xì)胞內(nèi)的總糖量(P<0.05)，但在24 h和36 h時(shí)，兩者沒(méi)有顯著差異。與單獨(dú)胰島素組相比，在12 h和18 h時(shí)，棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組對(duì)細(xì)胞內(nèi)的總糖量沒(méi)有顯著影響，但在24 h(P<0.01)和36 h(P<0.001)時(shí)，棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組顯著降低細(xì)胞內(nèi)的總糖量，其結(jié)果與葡萄糖消耗量實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相一致。

A：標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：細(xì)胞總糖量測(cè)定；相互比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖5 不同處理時(shí)間HTR8-S/Vneo細(xì)胞總糖量的變化

討 論

胰島素抵抗是指靶器官對(duì)正常濃度的胰島素反應(yīng)不足，表現(xiàn)為外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用障礙，是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病原因之一[7]。在導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生的假說(shuō)中，炎癥假說(shuō)近年來(lái)備受關(guān)注[8]，其中，由棕櫚酸誘導(dǎo)中產(chǎn)生脂肪因子作為炎癥因子，是否會(huì)引起胎盤(pán)的胰島素抵抗作用，誘發(fā)妊娠糖尿病，是本實(shí)驗(yàn)關(guān)注的重點(diǎn)。

近年來(lái)，棕櫚酸與胰島素通路之間的作用備受關(guān)注。Pardo等[9]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中，棕櫚酸濃度引發(fā)早期激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)與壓力相關(guān)的激酶，使凋亡細(xì)胞的比例增加，下調(diào)IR/IRS1/Akt胰島素通路。Mayer等[10]也提出棕櫚酸調(diào)控胰島素活動(dòng)，棕櫚酸減少會(huì)刺激胰島素Akt Ser473磷酸化。棕櫚酸造成胰島素信號(hào)通路缺陷[11-12]，而引起胰島素抵抗，在肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞均有文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，但在HTR8-S/Vneo細(xì)胞中，尚未有棕櫚酸誘導(dǎo)胰島素抵抗模型的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，可為胎盤(pán)中棕櫚酸與胰島素間的相關(guān)功能研究提供便利。

由于棕櫚酸和胰島素長(zhǎng)時(shí)間處理都會(huì)影響細(xì)胞活性，為避免由于細(xì)胞活性改變導(dǎo)致的葡萄糖消耗量改變，我們分析了棕櫚酸和胰島素處理后細(xì)胞活性不變的最佳濃度。我們選取HTR8-S/Vneo為研究對(duì)象，用不同濃度的棕櫚酸和胰島素處理細(xì)胞，并使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，判斷細(xì)胞活性。發(fā)現(xiàn)在棕櫚酸濃度為0.125 mmol/L和胰島素濃度為100 nmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞毒性最小，基本不影響細(xì)胞增值，最接近體內(nèi)環(huán)境，故選做實(shí)驗(yàn)處理濃度。馮沖等[16]實(shí)驗(yàn)選擇胰島素濃度時(shí)未對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行限定。

本實(shí)驗(yàn)分別使用棕櫚酸和胰島素兩種誘因誘導(dǎo)形成胰島素抵抗模型。胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，HTR8-S/Vneo細(xì)胞對(duì)胰島素敏感(P<0.05)，胰島素組葡萄糖消耗量及細(xì)胞總糖量相較對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，在36 h時(shí)仍未出現(xiàn)抑制葡萄糖消耗和糖類生成的促進(jìn)作用。本研究中，在12 h、18 h時(shí)，棕櫚酸組細(xì)胞內(nèi)總糖量顯著低于棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組(P<0.05)，到了24 h和36 h，棕櫚酸處理組和棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組間顯著差異消失(P>0.05)，且胰島素組的葡萄糖消耗量和細(xì)胞總糖量顯著高于棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理組(P<0.05)。說(shuō)明該條件下細(xì)胞已對(duì)胰島素產(chǎn)生耐受，并可維持一段時(shí)間。已有文獻(xiàn)報(bào)道棕櫚酸影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[17-19]，長(zhǎng)時(shí)間暴露于棕櫚酸會(huì)損害胰島素激活，從而解釋了加入棕櫚酸后，與胰島素處理組相比趨勢(shì)明顯緩和，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

馮沖等[16]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HTR8-S/Vneo細(xì)胞中48 h形成胰島素抵抗，而本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)棕櫚酸誘導(dǎo)的HTR8-S/Vneo細(xì)胞在24 h已表現(xiàn)出胰島素不敏感，葡萄糖消耗量和總糖量無(wú)明顯變化，并在36 h時(shí)持續(xù)作用。這可能是由于我們使用的處理系統(tǒng)不一樣，馮沖等[16]使用單純胰島素處理細(xì)胞，而我們選擇了具有胰島脂毒性的棕櫚酸與胰島素協(xié)同處理細(xì)胞，由于棕櫚酸的脂毒性作用誘導(dǎo)胰島素通路變化，使胰島素抵抗提前發(fā)生[20-21]。我們結(jié)果也顯示在36 h單獨(dú)胰島素處理未形成胰島素抵抗，與馮沖等[16]的結(jié)果一致。這提示了單獨(dú)的胰島素處理細(xì)胞需要更長(zhǎng)的時(shí)間產(chǎn)生胰島素抵抗，而棕櫚酸-胰島素協(xié)同處理大大縮短了細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗的時(shí)間，這種胰島素抵抗模型更適合用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源基因，檢測(cè)外源基因?qū)σ葝u素抵抗的影響。

由此我們得出，棕櫚酸胰島素抵抗模型的建立依賴于反應(yīng)時(shí)間，在0.125 mmol/L棕櫚酸與胰島素協(xié)同處理24 h時(shí)，誘發(fā)HTR8-S/Vneo細(xì)胞形成胰島素抵抗，成功建立棕櫚酸誘導(dǎo)的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞胰島素抵抗模型。

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