劉項(xiàng)，張杜平，張洲*，孫建華，季興哲，楊杰，石絨，宋娟，孫崢，任鵬飛，王磊，高明，周梁

(1.西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003；2.兵器工業(yè)521醫(yī)院，西安 710065)

男性因素導(dǎo)致的不育越來越受到人們的重視，單獨(dú)男方因素及合并男方因素引起的夫婦不孕不育約占50%。卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)在治療重度男性不育方面具有非常重要的意義[1]，ICSI技術(shù)極大程度的降低了對(duì)精子的密度、活力、畸形率、精子穿透能力的要求[2]，甚至對(duì)于那些通過顯微取精技術(shù)自睪丸獲得的精子也有機(jī)會(huì)通過ICSI助孕獲得血親子代。然而對(duì)于中、重度少弱精患者，精子質(zhì)量會(huì)有變差的可能，部分患者甚至在妻子取卵日不能順利取到可用做ICSI助孕的精子，因此對(duì)于這些患者，于試管助孕前行精子冷凍保存是保證助孕過程順利進(jìn)行的一個(gè)不錯(cuò)的選擇。但冷凍精子是否影響試管助孕結(jié)局，目前尚未形成統(tǒng)一意見[3-6]。有些學(xué)者認(rèn)為凍融精子與新鮮射出精子對(duì)ICSI結(jié)局無明顯影響，而有人持相反意見：認(rèn)為精子在冷凍過程中會(huì)對(duì)精子造成一定的損傷，并且冷凍精子的復(fù)蘇率及回收率也會(huì)降低，復(fù)蘇后精子活動(dòng)力降低、DNA斷裂，從而影響ICSI的治療。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)睪丸及附睪精子的新鮮及凍融精子的妊娠結(jié)局研究較多，但對(duì)新鮮射出精子與凍融射出的精子行ICSI妊娠結(jié)局研究較少，而對(duì)不同程度的新鮮射出精子和凍融精子的ICSI妊娠結(jié)局研究更少。本研究對(duì)在我中心接受ICSI治療的240個(gè)周期進(jìn)行回顧性分析，旨在探討新鮮射出的中、重度少弱精子和凍融的中、重度少弱精子對(duì)ICSI結(jié)局的影響

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年3月至2015年5月在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受ICSI治療的240個(gè)周期。納入周期的患者皆因男方精子質(zhì)量較差而于我院精子庫行精子冷凍保存，共有227人。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男方至少經(jīng)3次精液分析檢查，因上述原因于我院行精子冷凍保存成功的中、重度少弱精子癥患者；(2)近3個(gè)月內(nèi)的精液檢查無支原體、衣原體、淋球菌等異常；(3)夫婦雙方染色體均正常；(4)女方無子宮畸形及卵巢低反應(yīng)(取卵日獲卵數(shù)<4枚)，年齡<35歲，非多囊卵巢綜合征；(5)無遺傳性及家族性病史。

所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 分組：根據(jù)ICSI的精子來源，分為新鮮射出重度少弱精子組(A組)：107例111個(gè)周期，于妻子采卵日先試行留取新鮮精子，濃度<5×106/ml，且PR級(jí)<10%；新鮮射出中度少弱精子組(B組)：71名患者76個(gè)周期，濃度5～10×106/ml，且10%≤PR級(jí)<20%；凍融中、重度少弱精子組(C組)：49名患者53個(gè)周期，新鮮射出精液未找見活精子，采用事前于我院精子庫凍存的精子，解凍凍存精子，倒置顯微鏡下觀察/尋找活動(dòng)精子，行ICSI。

2. 精子制備：(1)新鮮精液：取卵當(dāng)天，男方禁欲3～7 d內(nèi)手淫獲得精液，選擇密度梯度離心法或上游法收集活動(dòng)精子；(2)凍融精子：將凍存的精子在取卵當(dāng)日解凍，解凍過程如下：自液氮中取出精子冷凍管，將其投入37℃水浴中10 min，融解后倒置顯微鏡下觀察，若有活動(dòng)精子，則用精子分離液(Spermrinse，Quins，美國(guó))常規(guī)洗滌精子2遍，2次離心后再次加入Spermrinse液，轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿行ICSI；若未找見活精子，則考慮行睪丸穿刺，但不歸入凍融組。

3. 受精、卵裂觀察、胚胎移植和ICSI結(jié)局判斷：顯微注射后16～18 h觀察受精情況，鏡下見2原核為正常受精。受精后24 h開始觀察卵裂情況，根據(jù)卵裂球的數(shù)目、大小、形狀、均勻程度、有無碎片等對(duì)胚胎進(jìn)行分級(jí)(表1)。2原核(2PN)I級(jí)和II級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。移植后12 d測(cè)血HCG，陽性者診斷為妊娠。胚胎移植后28～35 d B超顯示孕囊或原始心管波動(dòng)者診斷為臨床妊娠，妊娠終止發(fā)生在12周前診斷為早期流產(chǎn)。

表1 移植胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

共納入240個(gè)ICSI周期，3組患者男、女雙方年齡和不育年限、HCG日E2水平、子宮內(nèi)膜厚度、可用胚胎數(shù)情況見表2，HCG日E2水平、子宮內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

二、臨床結(jié)局比較

3組間ICSI治療的臨床結(jié)局比較：A組、B組與C組相比，可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；3組患者在可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組、B組在可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 一般情況比較(-±s)

表3 ICSI治療臨床結(jié)局比較(%)

注：與C組比較，**P<0.01

討 論

一、精子冷凍保存對(duì)試管助孕的意義

ICSI技術(shù)是直接將精子注射入卵細(xì)胞內(nèi)，使得精、卵結(jié)合，形成受精卵，成為治療中、重度少弱精子癥導(dǎo)致的男性不育的重要手段。但對(duì)于重度少弱精子癥、隱匿精子癥、逆行射精癥患者，若新鮮射出精子未找見活精子，多數(shù)患者需改行有創(chuàng)的睪丸或附睪穿刺取精手術(shù)，這類手術(shù)會(huì)破壞血睪屏障，并可能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生自身免疫反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者[7-8]對(duì)睪丸穿刺后患者的機(jī)體免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：血睪屏障的破壞使得睪丸中的精子抗原突破血睪屏障進(jìn)入血液，會(huì)產(chǎn)生抗精子抗體(AsAb)，AsAb多結(jié)合于精子尾部(68.9%)，影響精子的運(yùn)動(dòng)及受精。另外附睪的反復(fù)穿刺會(huì)造成附睪尾部阻滯機(jī)化，導(dǎo)致附睪管進(jìn)一步梗阻，為再次穿刺帶來風(fēng)險(xiǎn)。因此，為順利完成試管助孕周期，避免反復(fù)手術(shù)操作對(duì)患者造成的創(chuàng)傷，提前冷凍保存精子是非常重要的。

目前，國(guó)內(nèi)外已廣泛使用凍融的睪丸附睪精子行ICSI助孕，其妊娠結(jié)局及對(duì)子代的安全性無顯著差異[9-11]。甚至有研究認(rèn)為，凍融技術(shù)的篩選能淘汰一些質(zhì)量較差的胚胎和卵母細(xì)胞[12]。因此，在試管助孕治療中，對(duì)于重度少弱精子癥患者進(jìn)周期前行精子冷凍保存是一個(gè)經(jīng)濟(jì)、方便、安全而且有效的措施。

二、中、重度少弱精子癥患者新鮮射出精子與凍融精子的ICSI結(jié)局

國(guó)內(nèi)外關(guān)于睪丸精子、附睪精子及凍融睪丸、附睪精子對(duì)ICSI結(jié)局影響的研究較多，但爭(zhēng)議較大[11，13-17]。對(duì)正常精液和輕、重度弱精子癥患者射出的新鮮精子ICSI結(jié)局的研究發(fā)現(xiàn)，輕度弱精子癥患者ICSI后的受精率和卵裂率與正常射出精子者無顯著差異，優(yōu)質(zhì)胚胎率低于正常射出精子者。重度弱精子癥患者的受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均低于正常射出精子者。囊胚形成率在正常射出精子者、輕度弱精子癥和重度弱精子癥者依次下降，可能與重度少弱精子癥的精液中活性氧水平增加引起氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的精子損傷不僅影響精子的受精能力，還影響受精后胚胎的發(fā)育能力[6]。本研究中，中、重度少弱精子癥患者凍融精子組的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著低于新鮮射出精子組(P<0.05)，而中度和重度少弱精子癥患者間新鮮射出精子的用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本中心自2003年開展ICSI助孕技術(shù)，而本研究中所選樣本為2014～2015年期間，該時(shí)間段技術(shù)比較成熟，技術(shù)水平比較穩(wěn)定。因此本研究認(rèn)為凍融組可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率劣于新鮮組的結(jié)論不受實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平的差異干擾。Park等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)凍融精子與新鮮精子的優(yōu)質(zhì)胚胎率存在顯著差異，但它們之間臨床妊娠率無顯著差異。其原因可能與精子在冷凍復(fù)蘇過程中產(chǎn)生大量的活性氧有關(guān)，氧化應(yīng)激對(duì)精子中段、尾部的膜內(nèi)板損傷最大，進(jìn)而導(dǎo)致DAN損傷[19-22]。精子DNA損傷可能會(huì)影響胚胎的質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)凍融精子與新鮮精子ICSI治療的正常受精率、卵裂率、種植率和臨床妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此對(duì)于女方條件比較好，預(yù)計(jì)獲卵數(shù)較高的中、重度少弱精子癥患者，在試管助孕前可考慮行精子冷凍保存[23]，精子冷凍保存不僅可以避免睪丸穿刺對(duì)睪丸、附睪的損傷，也可以使得對(duì)生育力持續(xù)下降的患者保留了生育機(jī)會(huì)。

綜上所述，中、重度少弱精子癥患者凍融精子對(duì)ICSI的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率有一定的影響，但可以獲得與新鮮射出精子相似的妊娠結(jié)局。即便如此，對(duì)于中度、重度少弱精子癥患者在進(jìn)行ICSI助孕時(shí)，作為男科大夫應(yīng)該綜合考慮患者情況，再?zèng)Q定是否讓患者行精子冷凍保存，精子冷凍保存除了花費(fèi)一定的醫(yī)療成本外，更為重要的是可能會(huì)對(duì)精子造成一定的損傷，并進(jìn)一步影響胚胎質(zhì)量。但是對(duì)于某些在妻子取卵日不能順利取到可用精子的患者(如隱匿精子癥者、糖尿病等疾病造成的逆行射精者、手淫取精困難者)，建議試管助孕前首選對(duì)精子進(jìn)行冷凍保存。

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