張安龍, 王 曄, 王雪青, 黃昱杰, 劉佳偉
(1.陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)
能源危機和環(huán)境污染迫使人們?nèi)ふ噎h(huán)保、可再生的替代能源[1].氫能是一種高效、清潔、可持續(xù)的“無碳”能源,在地球上有巨大的蘊藏量[2,3].目前,制備氫氣的方法主要有化石燃料制氫、電解水制氫、甲醇轉(zhuǎn)化制氫和生物制氫[4],而生物制氫由于其成本低廉、原料豐富、適應(yīng)性好、底物轉(zhuǎn)化率高以及產(chǎn)物純度高的特點具有廣闊的發(fā)展前景[5-7].農(nóng)業(yè)廢棄物含有豐富的纖維素類生物質(zhì),如秸稈等.我國是農(nóng)業(yè)大國,每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物超過10億噸,其綜合利用率不到50%[8],利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵生物制氫具有顯著的優(yōu)勢,可以在提供清潔能源的同時,幫助滿足二氧化碳減排的需要,并實現(xiàn)廢物處理的目的[9].此方法操作簡便,成本低,實現(xiàn)了農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用,被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的制氫方法之一.光合細(xì)菌作為光發(fā)酵的一種產(chǎn)氫菌種,可以在光照厭氧條件下利用光能進行光合作用,具有較高的產(chǎn)氫得率和產(chǎn)氫速率.目前已知的產(chǎn)氫光合細(xì)菌主要有深紅紅螺菌、莢膜紅假單胞菌、沼澤紅假單胞菌、類球紅細(xì)菌和莢膜紅細(xì)菌.隨著對光合細(xì)菌產(chǎn)氫機理的深入研究,光合細(xì)菌光發(fā)酵制氫已逐漸由理論研究轉(zhuǎn)向工程化應(yīng)用技術(shù)研究.同時,利用秸稈類生物質(zhì)制氫是可再生能源領(lǐng)域中的一個熱點研究課題[10,11].傳統(tǒng)的光合細(xì)菌處理生物質(zhì)的方法多采用暗發(fā)酵-光發(fā)酵兩步法制氫,其工藝流程復(fù)雜,工程化難度大[12].用光發(fā)酵一步法代替暗-光兩步法耦合制氫,可省去對暗發(fā)酵廢液的中間處理環(huán)節(jié),去除了暗發(fā)酵廢液對光發(fā)酵的銨抑制效應(yīng),在降低成本的同時,使工藝流程大大簡化.
造紙廢水中有大量纖維素和半纖維素等物質(zhì)的降解產(chǎn)物,所以本文以造紙污泥為研究對象,從中分離篩選高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌并進行以葡萄糖為底物碳源的產(chǎn)氫優(yōu)化實驗,對比其利用秸稈解聚液的產(chǎn)氫能力,旨在為光合細(xì)菌直接利用有機農(nóng)業(yè)廢棄物的一步法產(chǎn)氫研究提供菌種來源和科學(xué)數(shù)據(jù).
用于分離篩選產(chǎn)氫光合細(xì)菌的活性污泥來自于陜西省某造紙廠的廢水處理段,污泥呈絮狀、結(jié)構(gòu)比較松散,黑色,有不良?xì)馕?,并長期受日光照射,是分離光合細(xì)菌的良好來源.
(1)富集培養(yǎng)液[13]:蛋白胨3 g/L,酵母粉3 g/L,MgCl2·7H2O 0.15 g/L,CaCl20.1 g/ L.
(2)產(chǎn)氫培養(yǎng)液:葡萄糖5 g/L,L-谷氨酸0.88 g/L,10% NaCl 10 mL,營養(yǎng)液(次氮基三乙酸10.0 g,MgSO4·7H2O 29.5 g,CaCl2·2H2O 3.335 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.099 g,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.009 3 g,微量元素液50 mL,蒸餾水950 mL)20 mL/L,滅菌后加入磷酸鹽緩沖溶液(KH2PO468.05 g,K2HPO487.09 g,蒸餾水1 000 mL)20 mL/L,維生素溶液(煙酸0.1 mg/mL,煙酸硫胺0.05 mg/mL,生物素1 ug/mL)10 mL/L.
(3)固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉.
1.3.1 光合細(xì)菌的富集分離及篩選
(1)富集:取活性污泥2 g置于無菌注射器中,添加滅菌后的富集培養(yǎng)液20 mL,與泥樣震蕩混勻,用膠管和止水夾封口以隔絕空氣.將注射器置于光照培養(yǎng)箱中,在光照度4 000 lx左右,溫度30 ℃條件下進行培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液變?yōu)榧t色時,從中取出1 mL菌液,轉(zhuǎn)接入20 mL新鮮無菌富集培養(yǎng)液中,在相同培養(yǎng)條件下厭氧培養(yǎng)至培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為止,此時得到富集后的菌體培養(yǎng)液.
(2)純化:取1 mL的菌體培養(yǎng)液用無菌水按10-1~10-10梯度稀釋,分別取0.1 mL懸浮液于固體培養(yǎng)基平板進行涂布分離操作,將培養(yǎng)皿倒置于密封培養(yǎng)罐后放入光照培養(yǎng)箱中,在光照度4 000 lx左右,溫度30 ℃條件下厭氧培養(yǎng).當(dāng)平板上長出單菌落,挑取不同特征的單個紅色菌落重復(fù)劃線分離多次,在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)一致時可認(rèn)為獲得純菌.
(3)篩選:對分離得到的光合細(xì)菌進行產(chǎn)氫實驗,分別接種到含有10 mL產(chǎn)氫培養(yǎng)液的注射器中,在光照度4 000 lx左右,溫度30 ℃,厭氧條件下進行培養(yǎng),每隔12 h測定產(chǎn)氫量,選擇產(chǎn)氫性能好的菌種作為研究對象并對其進行鑒定.
1.3.2 菌株的產(chǎn)氫性能優(yōu)化
將分離篩選得到的高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌落接種到培養(yǎng)液中進行擴大培養(yǎng),當(dāng)其生長至對數(shù)期時,按5%的接種量接種至產(chǎn)氫反應(yīng)液中.將反應(yīng)器置于光照培養(yǎng)箱中,在光照度4 000 lx左右,溫度30 ℃,厭氧條件下進行培養(yǎng),定時測定產(chǎn)氫量,每組設(shè)置三個平行實驗.考察不同濃度碳源、氮源以及磷酸鹽緩沖液添加量對細(xì)菌產(chǎn)氫性能的影響,得到最佳產(chǎn)氫組合.
1.3.3 光合細(xì)菌利用秸稈解聚液制氫
通過酸水解的方法獲得秸稈解聚液并測定其還原糖濃度,按照優(yōu)化后的氮源濃度和磷酸鹽緩沖液添加量配制產(chǎn)氫反應(yīng)液,并加入相應(yīng)體積的秸稈解聚液作為碳源,比較菌株利用相同濃度的葡萄糖作為碳源時,其產(chǎn)氫性能的差異.
1.4.1 菌液濃度測定
采用比濁法測定菌體濃度,用紫外分光光度計測定菌液在波長為600 nm時的吸光度,記為OD600.
1.4.2 氣體成分的測定
利用島津GC-2014氣相色譜儀進行氣相成分分析,載氣為氮氣,流速70 mL/min,柱室溫度70 ℃,氣化室溫度80 ℃,檢測器100 ℃,進樣量100μL.
1.4.3 還原糖的測定
采用DNS法(即3-5二硝基水楊酸法)測定秸稈解聚液中的總還原糖濃度.
1.4.4 產(chǎn)氫參數(shù)擬合
參考Gompertz方程得到修正后的產(chǎn)氫擬合曲線:
(1)
式(1)中:H—細(xì)菌發(fā)酵所產(chǎn)生的氫氣體積(mL/L);Hmax—細(xì)菌可能產(chǎn)生的最大氫氣體積(mL/L);Rm—細(xì)菌的最大產(chǎn)氫速率( L/(L·h) );λ—細(xì)菌產(chǎn)氫的延滯時間(h);t—反應(yīng)時間(h);e—為自然對數(shù),數(shù)值為2.718 28.
通過分離、純化和產(chǎn)氫測試,篩選得到一株高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌,命名為QW02,并對其進行16S rDNA基因序列測定分析[14],將所得序列通過NCBI基因庫中的序列進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,圖1為菌株QW02的系統(tǒng)發(fā)育樹,表明其屬于莢膜紅細(xì)菌屬(Rhodobactercapsulatus).
圖1 菌株QW02的系統(tǒng)發(fā)育樹
碳源是光合細(xì)菌產(chǎn)氫的供氫體,對光合細(xì)菌的生長和產(chǎn)氫性能起著至關(guān)重要的作用,葡萄糖作為細(xì)菌生長的一種理想碳源,可以作為產(chǎn)氫基質(zhì)被利用,也是秸稈解聚液的一種重要單糖成分.本實驗以葡萄糖為唯一碳源,在溫度為30 ℃、初始pH為7.1的條件下[15],研究不同葡萄糖濃度對光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響.
由圖2可以看出,在一定的光照條件下,碳源濃度對菌株產(chǎn)氫性能的影響比較大.表1為光合細(xì)菌利用不同濃度葡萄糖的產(chǎn)氫動力學(xué)參數(shù),隨著葡萄糖濃度的不斷增加,最大產(chǎn)氫得率呈現(xiàn)一個先增后減的趨勢,當(dāng)葡萄糖濃度增加到6 g/L時,最大產(chǎn)氫得率為2 273.4 mL/L,最大產(chǎn)氫速率為94.5 mL/(L·h).隨后再增加葡萄糖濃度,最大產(chǎn)氫得率與速率均呈現(xiàn)下降的趨勢.說明光合細(xì)菌產(chǎn)氫時,對碳源的利用能力有限,碳源濃度過低,不能保證細(xì)菌的生長和產(chǎn)氫;濃度過高,葡萄糖分解產(chǎn)生的有機酸會對光合細(xì)菌內(nèi)的產(chǎn)氫代謝途徑產(chǎn)生抑制[16].所以,需要在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)選擇葡萄糖濃度,提高產(chǎn)氫得率.
圖2 不同葡萄糖濃度下光合細(xì)菌累積產(chǎn)氫量隨時間的變化
濃度/(g/L)Gompertz方程Hm/(mL/L)Rm/(mL/(L·h))λ/hR221132.0±5.475.3±4.557.2±4.31.000062273.4±22.194.5±5.23.1±0.70.998482096.5±34.885.6±3.76.1±0.90.9972101915.6±65.670.0±4.67.8±1.30.9993141800.3±15.357.2±4.33.3±0.60.9964
2.3 氮源濃度對光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響
氮源是微生物生長代謝所必需的物質(zhì),氮源的主要作用是合成細(xì)胞中的含氮物質(zhì),一般不用做能源物質(zhì).光合細(xì)菌產(chǎn)氫主要是由固氮酶催化,不同的氮源種類及不同的C/N對光合細(xì)菌的產(chǎn)氫均有顯著影響.氮源對光合細(xì)菌產(chǎn)氫活性的影響主要表現(xiàn)為對固氮酶活性的影響,當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中NH4+濃度過高時不僅會抑制固氮酶的產(chǎn)氫活性,使菌體產(chǎn)氫能力下降[17],還會影響光合細(xì)菌通過光合磷酸化產(chǎn)生ATP,導(dǎo)致光合細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ATP水平偏低,不能為產(chǎn)氫提供足夠的能量,造成產(chǎn)氫量的下降.本試驗以L-谷氨酸為唯一氮源,在溫度為30 ℃、初始pH為7.1、葡萄糖濃度為6 g/L的條件下,研究不同氮源濃度對光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響.
結(jié)合圖3與表2的產(chǎn)氫動力參數(shù)可以看出,隨著L-谷氨酸濃度在2~18 mmol/L范圍內(nèi)的不斷增加,累積產(chǎn)氫量與最大產(chǎn)氫得率與速率也不斷增加.在濃度為18 mmol/L時,獲得最大產(chǎn)氫得率與速率,分別為2 828.2 mL/L和111.7 mL/(L·h),隨著氮源濃度的繼續(xù)增加,最大產(chǎn)氫得率與速率相繼減少.說明18 mmol/L的谷氨酸濃度為產(chǎn)氫適宜濃度,此時,產(chǎn)氫延滯期相對較短,菌體具有較強的產(chǎn)氫活性.雖然在濃度為2 mmol/L時產(chǎn)氫延滯期最短,但是最大產(chǎn)氫得率最低,說明當(dāng)?shù)床蛔銜r,細(xì)菌沒有足夠充足的能量合成蛋白質(zhì),而導(dǎo)致沒有足夠的生物量,無法保證產(chǎn)氫代謝進行;而當(dāng)?shù)礉舛瘸^18 mmol/L時,最大產(chǎn)氫得率下降可能是因為谷氨酸濃度過高時游離出NH4+,抑制了固氮酶的活性,從而使細(xì)菌的光合產(chǎn)氫作用受到抑制,表現(xiàn)為產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫活性的下降.
圖3 不同氮源濃度下光合細(xì)菌累積產(chǎn)氫量隨時間的變化
濃度/(mmol/L)Gompertz方程Hm/(mL/L)Rm/(mL/(L·h))λ/hR221028.9±13.438.6±2.53.0±0.90.997461325.9±22.142.3±2.83.3±1.00.9968102034.0±42.142.5±5.23.6±2.60.9859142376.9±92.468.4±9.33.7±2.30.9854182828.2±18.1111.7±3.64.5±0.40.9854222537.6±38.779.2±3.83.6±1.20.9990
培養(yǎng)液中的磷酸鹽不僅給微生物提供細(xì)胞生長所需要的磷源,而且提供了一種緩沖體系,維持培養(yǎng)基中酸堿度的穩(wěn)定及其它礦質(zhì)元素的平衡,有利于微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用.有研究表明,莢膜紅細(xì)菌中固氮酶和氫酶所需的最適pH范圍7.1~7.3,過酸過堿都會影響光合細(xì)菌的產(chǎn)氫相關(guān)酶活性,從而影響產(chǎn)氫量[18],因此磷酸鹽的存在就可以為光合細(xì)菌維持一個相對穩(wěn)定的酸堿環(huán)境.本試驗在溫度為30 ℃、初始pH為7.1、葡萄糖濃度為6 g/L、L-谷氨酸濃度為18 mmol/L的條件下,研究不同磷酸鹽緩沖液添加量對光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響.
結(jié)合圖4和表3可以看出,隨著磷酸鹽緩沖液添加量的增大,其最大產(chǎn)氫速率和得率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當(dāng)磷酸鹽緩沖液添加量為20 mL/L時,其最大產(chǎn)氫得率與速率最大,分別為3 397.0 mL/L和125.3 mL/(L·h).而后隨著磷酸鹽緩沖液濃度的不斷增大,其最大產(chǎn)氫速率和得率均所下降.可見,并非磷酸鹽緩沖液的濃度越高,緩沖能力越強,過多的磷酸鹽緩沖溶液會改變細(xì)菌胞內(nèi)的滲透壓,從而改變細(xì)菌的生長代謝,因此會對產(chǎn)氫帶來抑制作用.
圖4 不同磷酸鹽緩沖液添加量下光合細(xì)菌累積產(chǎn)氫量隨時間的變化
添加量/(mL/L)Gompertz方程Hm/(mL/L)Rm/(mL/(L·h))λ/hR2102910.9±56.766.0±10.24.4±0.90.9977203397.0±48.1125.3±7.73.1±2.40.9987403290.4±24.398.1±7.55.9±0.30.9996603137.9±38.472.6±5.57.6±0.50.9986801813.9±32.152.6±5.612.4±0.60.9964
將已知還原糖濃度的秸稈解聚液pH調(diào)節(jié)至7.1,以作為產(chǎn)氫反應(yīng)液的底物碳源.按照優(yōu)化后的氮源濃度和磷酸鹽緩沖液添加量配制產(chǎn)氫反應(yīng)液,并加入相應(yīng)體積的秸稈解聚液(還原糖濃度6 g/L)作為碳源,研究光合細(xì)菌利用秸稈解聚液的產(chǎn)氫能力.以生物質(zhì)秸稈的解聚液做為底物進行光合細(xì)菌的產(chǎn)氫反應(yīng)時,其中主要是以葡萄糖,木糖等小分子單糖混合物提供碳源[11].所以用相同濃度的葡萄糖作為碳源,比較其與秸稈解聚液作為碳源時,其產(chǎn)氫性能的差異.
如圖5和表4所示,光合細(xì)菌利用秸稈解聚液的產(chǎn)氫性能優(yōu)于葡萄糖,最大產(chǎn)氫量為3 944.2 mL/L,最大產(chǎn)氫速率為153.5 mL/(L·h),這兩項指標(biāo)均優(yōu)于光合細(xì)菌利用葡萄糖為底物碳源時的.其次,光合細(xì)利用秸稈解聚液的產(chǎn)氫遲滯時間也比較短,可能是因為秸稈解聚液中還有其他小分子酸被作為碳源利用.
圖5 光合細(xì)菌在兩種碳源條件下的累積產(chǎn)氫曲線
碳源Gompertz方程Hm/(mL/L)Rm/(mL/(L·h))λ/hR2葡萄糖3552.7±26.4131.8±5.25.3±0.50.9988秸稈解聚液3944.2±45.8153.5±16.84.9±1.40.9923
由圖6可以看出,在兩種碳源條件下,產(chǎn)氫液pH均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當(dāng)以葡萄糖作為碳源時,pH在36 h左右上升到最大值為7.31.之后,pH值隨著產(chǎn)氫反應(yīng)的持續(xù)進行,一直呈現(xiàn)下降趨勢,96 h左右時,pH下降至5.84.依據(jù)上述實驗結(jié)果,說明光合細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)氫的過程存在著代謝產(chǎn)酸的過程,且產(chǎn)酸的速度快于有機酸分解的的過程,菌液的酸化使菌體的生長活性下降,生長受到抑制并發(fā)生衰亡自溶,因此菌體的產(chǎn)氫活性也受到一定抑制,產(chǎn)氫穩(wěn)定性較差.而以秸稈解聚液作為碳源時,pH在36 h上升到最大值7.46.之后,pH值隨著產(chǎn)氫反應(yīng)的持續(xù)進行呈現(xiàn)略微下降,72 h后,pH最終穩(wěn)定在7左右.這說明在秸稈解聚液中,除了糖類占大多數(shù)外,還存在一部分小分子揮發(fā)性有機酸或有機酸鹽[19],這部分小分子酸可以以碳源的形式被光合細(xì)菌利用,而光合細(xì)菌利用小分子酸產(chǎn)氫的過程是一個pH升高的過程,因此在整個產(chǎn)氫過程中,pH都呈現(xiàn)出較強生物自穩(wěn)性.
圖6 兩種碳源條件下光合細(xì)菌產(chǎn)氫液pH變化曲線
為了進一步探究光合細(xì)菌在以秸稈解聚液和葡萄糖作為底物時,其產(chǎn)氫性能提高的機理,本文測試了以兩種不同底物作為碳源時的產(chǎn)氫反應(yīng)液在產(chǎn)氫過程中的OD600,得出生物量的變化規(guī)律.由圖7可以看出,兩種碳源條件下生物量都呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢,而以秸稈解聚液為碳源時,其生物量在整個產(chǎn)氫周期中,要明顯高于以葡萄糖作為碳源時的生物量.結(jié)合前面的實驗,說明秸稈解聚產(chǎn)氫液pH的自穩(wěn)效應(yīng)可以使細(xì)菌保持較高的生長活性,提供足夠的生物量,這是秸稈解聚液作為碳源時高產(chǎn)氫得率與速率的關(guān)鍵.
圖7 兩種碳源條件下光合細(xì)菌產(chǎn)氫液生物量變化曲線
(1)為篩選出高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌,對從造紙廠采集的活性污泥進行馴化后分離篩選得到一株高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌QW02,對其進行16S rDNA序列對比分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明QW02屬于莢膜紅細(xì)菌.
(2)通過單因素實驗確定菌株獲得最大產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率的條件為葡萄糖為6 g/L,谷氨酸為18 mmol/L,磷酸鹽緩沖液濃度為20 mL/L.
(3)在單因素優(yōu)化的條件下分別以葡萄糖和秸稈解聚液為碳源對菌株進行產(chǎn)氫實驗.結(jié)果表明,菌株利用秸稈解聚液的產(chǎn)氫得率優(yōu)于以葡萄糖為碳源時的得率,其最大產(chǎn)氫量為3 944.2 mL/L,最大產(chǎn)氫速率高達153.5 mL/(L·h),反應(yīng)遲滯時間短,pH變化幅度較小,具有一定的自穩(wěn)效應(yīng),因而使其產(chǎn)氫周期較長,并且生物量在整個產(chǎn)氫過程中始終高于以葡萄糖作為碳源時的生物量.證實了利用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化秸稈解聚液的一步法光合產(chǎn)氫的可行性.
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