潘兆寶 吉華青 韓麗芳 董安山 史立宏

261000濰坊市第二人民醫(yī)院1

261000濰坊醫(yī)學(xué)院2

本研究特對(duì)78例肺癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行對(duì)照研究，以期明確miR-204在肺癌組織中相對(duì)表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系，為該基因表達(dá)在肺癌發(fā)病過程中作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

研究設(shè)計(jì)：本研究采用前瞻性、空白對(duì)照方法設(shè)計(jì)、開展試驗(yàn)探究。

研究對(duì)象：選取我院2014年6月-2016年4月行肺癌切除術(shù)的78例石蠟存檔組織標(biāo)本作為研究對(duì)象。取肺癌組織作為試驗(yàn)組，取癌旁正常組織(距癌癥組織≥3 cm)作為對(duì)照組。78例患者均為原發(fā)性肺癌，且符合孫麗慧2011年《現(xiàn)代腫瘤學(xué)》中肺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男42例，女36例；年齡45～72歲，平均(58.72±5.13)歲；病程1～30個(gè)月，平均(16.78±5.04)個(gè)月；腫瘤長徑2.0～7.7 cm，平均(4.32±0.71)cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無55例；TNM分期為Ⅰ期32例，Ⅱ期25例，≥Ⅲ期21例；分化程度為高分化27例，中分化29例，低分化22例；組織類型為鱗癌39例，腺癌19例，非小細(xì)胞癌14例，其他6例。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均為原發(fā)性肺癌，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)；②均行根治性切除術(shù)，且符合手術(shù)指征；③切除組織均行石蠟存檔處理。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型原發(fā)性惡性腫瘤，肺部轉(zhuǎn)移者；②肺部良性腫瘤者；③合并其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者。

試劑和儀器：Trizol RNA提取試劑盒(購自美國Invitrogen公司)；熒光定量RT-PCR反轉(zhuǎn)錄和定量染料(均購自大連Takara寶生物工程公司)；miRNA探針和引物(購自美國ABI公司)；臺(tái)式離心機(jī)(TDM5L型，購自湖南湘儀儀器公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V型，購自日本Sanyo集團(tuán))；RNA評(píng)估系統(tǒng)(Agilent 2100型，購自安捷倫科技公司)；熒光定量RT-PCR儀器(7900HT型，購自美國ABI公司)；miR-204逆轉(zhuǎn)錄引物序列(由美國ABI公司設(shè)計(jì)并合成)。

miRNA提取方法：采用Trizol提取總RNA，具體方法如下：①取試驗(yàn)組和對(duì)照組組織，逐漸添加液氮同時(shí)將其研磨，依次加入Buffer-Ⅰ裂解液和Buffer-Ⅱ裂解液，注意此過程中需要抽提；②行離心分離處理，將沉渣撇去后添加無水乙醇，并行離心處理，去濾液并將其中加入異丙醇，離心分離后將上清液撇去，添加濃度70%的乙醇，放置-20℃的恒溫冰箱中預(yù)冷后行離心分離處理，將上清液撇去，上述所有離心分離過程中轉(zhuǎn)速均設(shè)置為12 000 r/min，時(shí)間5 min；③將沉淀采用Buffer TE水洗脫miRNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量RT-PCR檢測方法：①取上述步驟所得樣品5 μL，向其中加入miR-204逆轉(zhuǎn)錄引物并行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)；②內(nèi)參設(shè)置為U6RNA，反應(yīng)總體積10 μL(需用無RNA酶H2O將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10 μL)；③PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，58℃水浴20 s，完成45個(gè)循環(huán)后，72℃退火30 s。在此過程中需注意將內(nèi)參U6RNA進(jìn)行擴(kuò)增以作為對(duì)照；④取裂解液PLB，用超純水稀釋5倍后加入反應(yīng)體系終止反應(yīng)后加入LA工作液100 μL，并采用熒光系統(tǒng)對(duì)miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量進(jìn)行檢測。

觀察指標(biāo)和判定標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)比試驗(yàn)組和對(duì)照組miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量；②對(duì)比不同臨床病理?xiàng)l件下miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0分析，計(jì)量資料采用(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

試驗(yàn)組和對(duì)照組miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量比較：試驗(yàn)組miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量水平較對(duì)照組顯著降低，兩組數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量比較(x±s)

兩組miR-204熒光相對(duì)含量水平檢測圖(略)。

不同臨床病理?xiàng)l件下miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量比較：miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量在性別、年齡方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在病程、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度和組織類型等不同臨床病理?xiàng)l件下其熒光相對(duì)含量水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中病程≥12個(gè)月、腫瘤長徑≥5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM≥Ⅲ期、低分化和非小細(xì)胞肺癌miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量水平均遠(yuǎn)低于病程＜12個(gè)月、腫瘤長徑＜5 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ期和Ⅱ期、高分化和中分化、鱗癌和腺癌等含量水平，見表2。

表2 不同臨床病理?xiàng)l件下miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量比較(x±s)

討 論

目前臨床上對(duì)肺癌發(fā)生和進(jìn)展作用機(jī)制研究尚淺，僅有既往相關(guān)研究證實(shí)抽煙、藥物作用、生活和社會(huì)環(huán)境壓力增大等均是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)療技術(shù)水平的不斷發(fā)展和進(jìn)步，基因突變成為當(dāng)前公認(rèn)的癌癥發(fā)生的根本原因，且臨床上針對(duì)肺癌患者采用放化療有效性和敏感性均和多種相關(guān)基因表達(dá)水平存在關(guān)聯(lián)[2，3]。目前關(guān)于肺癌遺傳易感性和放化療有效性研究較多的基因，當(dāng)屬BCL-2、HMGA2、DHH、DTX1等，均有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程[5-6]。相關(guān)研究指出，上述基因在胃癌中也可能具有重要參與作用，通過對(duì)miRNAs作用調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)和功能，進(jìn)而誘導(dǎo)并促進(jìn)胃癌發(fā)生，其中以miR-204作用最為明顯[7]。因此探究miR-204在肺癌組織中表達(dá)水平及其和臨床病理的關(guān)系，對(duì)確定其是否參與肺癌發(fā)生和進(jìn)展、明確其作用機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。

miR-204具有多種生物學(xué)作用，在人體9號(hào)染色體上，對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨髓間質(zhì)母細(xì)胞的分化均具有重要調(diào)控作用。在不同類型的腫瘤發(fā)生過程中，miR-204表達(dá)水平和調(diào)控機(jī)制存在明顯不同。國外報(bào)道指出[8，9]，miR-204可以顯著抑制致癌相關(guān)蛋白水平，但是在子宮內(nèi)膜樣癌、宮頸癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中其表達(dá)水平均表現(xiàn)出顯著降低趨勢，提示miR-204對(duì)多種婦科惡性腫瘤具有顯著抑制作用，推測其靶基因很可能是具有積極作用，能夠增強(qiáng)放化療有效率的抑癌基因。另有研究通過體外人膽管癌細(xì)胞系miR-204培養(yǎng)和檢測研究[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性的miR-204能夠顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞凋亡率，且激發(fā)化療藥物5-氟尿嘧啶的療效，且Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著被抑制，推測和Bcl-2受到miR-204負(fù)向調(diào)控作用有關(guān)。在一項(xiàng)關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)[11]，miR-204過表達(dá)可顯著抑制病情惡化和進(jìn)展，對(duì)抑制遷移、侵襲、浸潤均具有顯著調(diào)控作用。

本研究結(jié)果中，試驗(yàn)組miR-204表達(dá)熒光相對(duì)含量較對(duì)照組顯著降低，且在病程、腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度和組織類型等臨床病理?xiàng)l件下其表達(dá)水平均差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-204低表達(dá)不僅和肺癌的發(fā)生關(guān)系緊密，對(duì)其侵襲、轉(zhuǎn)移、浸潤也很可能存在一定調(diào)控作用。但是其具體作用機(jī)制尚需深入探究，期待更多學(xué)者積極探索，為肺癌臨床防治提供更為合理、高效的方案。

[1]孫麗慧.現(xiàn)代腫瘤學(xué)[M].吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2011.

[2]洪成雨,徐倩,岳崢,等.非小細(xì)胞肺癌NP方案化療敏感性與DNA修復(fù)基因XRCC1多態(tài)性的關(guān)系[J].癌癥,2009,28(12):1291-1297.

[3]徐風(fēng)華,郭榮榮,李欣,等.非小細(xì)胞肺癌患者ERCC1表達(dá)與鉑類藥物化療敏感性的相關(guān)性的系統(tǒng)分析[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2013,18(1):45-50.

[4]Lehmann C,Friess T,Birzele F,et al.Superior anti-tumor activity of the MDM2 antagonist idasanutlin and the Bcl-2 inhibitor venetoclax in p53 wild-type acute myeloid leukemia models[J].J Hematol Oncol,2016,9(1):50.

[5]梁恒倫,李晶,童健,等.透明質(zhì)酸偶聯(lián)殼聚糖微球?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌的靶向性作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(21):3847-3850.

[6]?；蹚?申明惠,張毅,等.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白參與雷帕霉素誘導(dǎo)的肺癌95D細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J].山西醫(yī)藥雜志,2012,41(10):973-975.

[7]馬小芬,黃重發(fā),朱清.miR-204在胃癌生長中的作用及機(jī)制[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(20):2994-2997.

[8]Bachetti T,Di Zanni E,Ravazzolo R,et al.miR-204 mediates post-transcriptional down-regulation of PHOX2B gene expression in neuroblastoma Cells[J].Biochim Biophys Acta,2015,1849(8):1057-1065.

[9]Todorova K,Metodiev MV,Metodieva G,et al.miR-204 is dysregulated in metastatic prostate cancer in vitro[J].Mol Carcinog,2016,55(2):131-147.

[10]張彬彬.miR-204-5p通過靶向USP47與RAB22A抑制胃癌細(xì)胞增殖的研究[D].蘇州大學(xué),2015.

[11]劉洪建,張敬敬,王玉波,等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織MiR-204表達(dá)生物學(xué)意義研究[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(17):1382-1387.