唐驍爽，王 莉，王嗣岑(. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院，陜西西安 70004；. 西安交通大學藥學院，陜西西安 7006)

◇技術方法研究◇

分子印跡磁性納米粒的制備及其在蛋白質(zhì)分離純化中的應用

唐驍爽1，王 莉1，王嗣岑2
(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004；2. 西安交通大學藥學院，陜西西安 710061)

目的發(fā)展一種分子印跡磁性納米粒用于分離純化目標蛋白質(zhì)的新策略。方法水熱法制備Fe3O4磁性納米粒，溶膠凝膠法制備分子印跡聚合物，動力學、等溫、特異性吸附考察分子印跡磁性納米粒吸附性能。結果所得聚合物可以在30 min內(nèi)達到吸附平衡，吸附量高達44.51 mg/g，印跡因子和選擇性因子分別為3.50和2.92，對牛血中的牛血紅蛋白質(zhì)有良好的特異性識別能力。結論所制備的分子印跡磁性納米粒及其良好的選擇性吸附性能為目標蛋白質(zhì)的分離純化提供了一條有效的途徑。

蛋白質(zhì)；分離；純化；分子印跡聚合物

蛋白質(zhì)組學通過對比健康與疾病狀態(tài)的細胞或組織的蛋白質(zhì)組表達差異，用于藥物研究或藥物受體研究，以評價藥物類似物的結構與活性關系，尋找高活性的藥物。蛋白質(zhì)組學的研究需要將目標蛋白質(zhì)從復雜生物樣品中分離出來再進行研究分析。目前，分離蛋白質(zhì)的主要技術有固定金屬親和色譜法[1]、雙向電泳技術[2]和毛細管電色譜[3]等方法，但是這些方法成本高、費時費力、穩(wěn)定性差。因此，發(fā)展蛋白質(zhì)分離純化新技術成為科學工作者關注的熱點。

分子印跡技術作為一種新型的對目標蛋白質(zhì)分子具有專一性識別作用的人工合成技術，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬癧4]。近年來，表面分子印跡技術被廣泛用于目標蛋白質(zhì)的分離和純化。其一般是以納米粒[5-8]為“核”，在“核”的表面發(fā)生聚合，形成聚合物“殼”。這種聚合方法在一定程度上解決了生物大分子由于體積龐大難以進出聚合物材料的問題，有利于目標蛋白質(zhì)接近識別位點。本研究以磁性納米粒為“核”，采用表面分子印跡技術，制備了牛血紅蛋白質(zhì)的分子印跡聚合物，以期能為目標蛋白質(zhì)的分離純化提供一條有效的途徑。

1 材料與方法

1.1材料四乙氧基硅烷(TEOS)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、三甲氧基辛基硅烷(OTMS)均購于英國Alfa Aesar化學試劑公司；牛血紅蛋白(BHb)和牛血清白蛋白(BSA)均購于Sigma公司；三羥甲基胺基甲烷(Tris)購于上海藍季科技有限公司；六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、乙二醇(EG)、聚乙二醇(PEG, MW 4000)、醋酸鈉(NaOAc)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)和乙醇均購于天津光復精細化工廠；水為超純水。

FA2004電子天平(上海上平儀器有限公司)；RW20機械攪拌器(德國艾卡公司)；9600-1振動樣品磁強計(美國 LDJ Electronics公司)；Bio-Rad電泳儀(美國伯樂公司)；UV-2450型紫外/可見分光光度計(日本島津公司)；TecnaiG2透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)；KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WGL-30B電熱恒溫鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HY-4調(diào)速多用振蕩器(常州國華電器有限公司)；聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應釜(鞏義市予泰儀器設備銷售有限公司)。

1.2方法

1.2.1Fe3O4磁性納米粒的制備 Fe3O4磁性納米粒通過一步水熱法制備獲得[9]，首先將1.01 g FeCl3·6H2O，2.8 g NaOAc，0.085 g PEG溶解于裝有20 mL EG溶液的聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應釜中，攪拌均勻后，密閉加熱至200 ℃反應12 h，然后冷卻至室溫。得到的黑色產(chǎn)物用超純水洗滌至上清液呈無色，50 ℃真空干燥12 h，即得Fe3O4磁性納米粒。

1.2.2分子印跡和非分子印跡聚合物的制備 將30 mg BHb溶解到盛有30 mL Tris-HCl(pH=7.0)緩沖溶液的三口瓶中，加入200 mg Fe3O4，攪拌30 min。再加入TEOS 2 mL，APTES和OTMS各100 μL，室溫下繼續(xù)攪拌反應3 h。所得產(chǎn)物用超純水洗滌直至上清液澄清，接著用0.1 mol/L NaOH洗脫BHb，在外加磁場作用下將聚合物與上清液分離，并將聚合物在50 ℃ 下真空干燥，即得BHb分子印跡聚合物(Fe3O4@BHb-MIPs)。非分子印跡聚合物(Fe3O4@NIPs)的制備，除不加BHb外，其余步驟同上。

1.2.3動力學吸附性能的考察 分別取Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs 20 mg置于10 mL質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的BHb Tris-HCl(pH=7.0)緩沖溶液中，室溫下，分別振蕩5、10、15、20、25、30、35、40、45 min，用磁鐵將聚合物和上清液分離。再用紫外-可見分光光度計檢測上清液中BHb的濃度。通過公式(1)計算相應的吸附量。

(1)

C0和Ce(mg/mL)分別指目標蛋白質(zhì)的起始和平衡濃度，V(mL)指吸附液的體積，W(g)指聚合物的質(zhì)量。

1.2.4等溫吸附性能的考察 分別取Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs 20 mg于10 mL質(zhì)量濃度為0.050 mg/mL～0.50 mg/mL的BHb Tris-HCl(pH=7.0)緩沖溶液中，室溫下振蕩30 min，后續(xù)處理同1.2.3。

1.2.5特異性吸附能力的考察 分別取Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs 20 mg于10 mL質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL的同時含有BSA和BHb的Tris-HCl(pH=7.0)標準混合溶液中，室溫下振搖30 min，后續(xù)處理同1.2.3。

1.2.6實際樣品的應用分析 取新鮮牛血樣品，用Tris-HCl(pH=7.0)緩沖溶液稀釋150倍。取50 mg Fe3O4@BHb-MIPs分散于上述稀釋的牛血樣品中，室溫下振蕩30 min后，用磁鐵將聚合物與上清液分離，吸附牛血后的聚合物用0.1 mol/L NaOH洗脫。稀釋的牛血樣，聚合物吸附后的牛血樣以及洗脫目標蛋白質(zhì)的洗脫液作為凝膠電泳的分析樣品。

2 結 果

2.1Fe3O4和Fe3O4@BHb-MIPs的透射電子顯微鏡(TEM)表征取適量Fe3O4和Fe3O4@BHb-MIPs均勻分散于一定量的乙醇中，將5 μL該混懸液滴加到銅網(wǎng)上，并在透射電子顯微鏡下觀察。結果如圖1所示，F(xiàn)e3O4(A)和Fe3O4@BHb-MIPs(B)都是類球形結構，且Fe3O4的粒徑在230 nm左右，F(xiàn)e3O4@BHb-MIPs的表面明顯有印跡層的存在，其粒徑大約在260 nm，表明印跡層的厚度約為15 nm。

2.2Fe3O4和Fe3O4@BHb-MIPs的磁滯回線表征各稱取Fe3O4和Fe3O4@BHb-MIPs 10～20 mg，300 K下，對樣品施加強度為-6 000 Oe～6 000 Oe的磁場，測定樣品的磁滯回線。結果如圖2所示，兩樣品的矯頑力和剩磁均很小，表現(xiàn)出良好的順磁性。Fe3O4@BHb-MIPs的飽和磁化強度低于Fe3O4的，這是由于印跡層的屏蔽效應引起的。但Fe3O4@BHb-MIPs的飽和磁化強度仍高達43.95 emu/g，能夠?qū)崿F(xiàn)聚合物在外加磁場引導下快速從吸附液中分離出來，這對于目標蛋白質(zhì)的大規(guī)模磁性分離非常有利。

圖1Fe3O4(A)和Fe3O4@BHb-MIPs(B)的TEM圖

Fig.1 TEM images of Fe3O4(A) and Fe3O4@BHb-MIPs (B)

圖2Fe3O4和Fe3O4@BHb-MIPs的磁滯回線圖

Fig.2 Magnetization curves of Fe3O4and Fe3O4@BHb-MIPs

2.3Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs吸附性能的考察動力學吸附性能的考察結果如圖3所示，聚合物在前25 min有較快的吸附速率，30 min時達到吸附平衡。聚合物吸附目標蛋白質(zhì)的初始階段，由于其表面有很多空的結合位點，因此吸附速率較快；隨著時間的延長，結合位點被目標蛋白質(zhì)所占據(jù)，吸附能力逐漸下降，最終達到吸附平衡。

圖3Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs的動力學吸附曲線

Fig.3 Adsorption kinetics of Fe3O4@BHb-MIPs and Fe3O4@NIPs

等溫吸附性能的考察結果如圖4所示，當BHb溶液濃度達到0.40 mg/mL時，聚合物對目標蛋白質(zhì)的吸附量達到平衡。另外，F(xiàn)e3O4@BHb-MIPs對BHb的吸附量遠大于Fe3O4@NIPs的。

圖4Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs的等溫吸附曲線

Fig.4 Adsorption isotherms of Fe3O4@BHb-MIPs and Fe3O4@NIPs

印跡因子(IF)和選擇性因子(SC)常用作評價分子印跡和非印跡聚合物選擇性吸附性能的重要參數(shù)。其定義如下：

(2)

(3)

QMIP和QNIP(mg/g)分別代表Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs對蛋白質(zhì)的吸附量，IFTEM和IFCOM分別代表目標蛋白質(zhì)和競爭蛋白質(zhì)的印跡因子。

BSA的體積和分子量都與BHb接近，且是牛血中存在的另一種高豐度蛋白質(zhì)，因此，以其作為競爭蛋白質(zhì)來衡量Fe3O4@BHb-MIPs對BHb的特異性吸附能力。結果如表1所示，F(xiàn)e3O4@BHb-MIPs對BHb的IF和SC值分別為3.50和2.92。

表1Fe3O4@BHb-MIPs和Fe3O4@NIPs對BHb及BSA的吸附量、印跡因子和選擇性因子

Tab.1 The adsorption capacities, imprinting factors, and selectivity coefficients of Fe3O4@BHb-MIPs and Fe3O4@NIPs for BHb and BSA

ProteinsQMIP(mg/g)QNIP(mg/g)IFSCBHb44．5112．713．50—BSA15．2312．671．202．92

2.4Fe3O4@BHb-MIPs在實際樣品中的應用如圖5所示，實際牛血樣品(Lane 1)經(jīng)Fe3O4@BHb-MIPs吸附后，樣品中BHb條帶明顯變淺，而其他條帶幾乎沒有明顯的變化(Lane 2)，當洗脫Fe3O4@BHb-MIPs后，洗脫液中BHb條帶又清晰地重新顯現(xiàn)(Lane 3)。這說明Fe3O4@BHb-MIPs只對實際牛血樣中的BHb有特異性吸附，而對其他蛋白質(zhì)分子幾乎沒有吸附作用。

圖5Fe3O4@BHb-MIPs應用于牛血樣品中的SDS-PAGE分析

Fig.5 SDS-PAGE analysis to evaluate the applicability of Fe3O4@BHb-MIPs towards BHb

Lane 0：標準蛋白分子量標記；Lane 1：稀釋150倍的牛血樣；Lane 2：經(jīng)Fe3O4@BHb-MIPs吸附后的牛血樣；Lane 3：用0.1 mol/L NaOH洗脫吸附后的Fe3O4@BHb-MIPs的上清液。

3 討 論

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物由于具有穩(wěn)定性好、易于制備、可重復利用和選擇性高等優(yōu)勢，被認為是一種可以從復雜基質(zhì)中去除高豐度蛋白質(zhì)的有效新型手段。表面分子印跡聚合物表面存在大量的印跡識別位點，有利于加快蛋白質(zhì)對位點的可接近性，可以解決蛋白質(zhì)傳質(zhì)速率慢的問題。蛋白質(zhì)組學的研究，首先需要將目標蛋白質(zhì)從復雜生物樣品中分離出來進行純化。Fe3O4磁性納米粒除具有一般納米粒的小尺寸效應、量子效應和表面效應外，還具有超順磁性、易于分離性、低毒性、良好的生物相容性等特性，被廣泛地應用于生物領域。本文以Fe3O4磁性納米粒為核，采用溶膠凝膠技術和表面分子印跡技術制備出包覆聚合物薄膜的核-殼型結構的材料。

所得分子印跡磁性納米粒與其他特異性吸附BHb的分子印跡聚合物相比較(5 h[10]，80 min[11])，本實驗所制備的聚合物到達吸附平衡的時間更短(30 min)，這主要是由于Fe3O4@BHb-MIPs的印跡層較薄，厚度僅為約15 nm，更有利于BHb在Fe3O4@BHb-MIPs和吸附液之間進行傳質(zhì)，極大地縮短了吸附時間，提高了吸附效率。

所得分子印跡磁性納米粒的吸附性能優(yōu)于非分子印跡磁性納米粒的吸附性能。主要是由于Fe3O4@BHb-MIPs具有大量的與目標蛋白質(zhì)的空間結構、大小尺寸完全匹配的識別位點，可以實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的特異性結合，而Fe3O4@NIPs對BHb的吸附作用是非特異性的。

Fe3O4@BHb-MIPs對BHb的吸附量高達44.51 mg/g，遠高于對競爭蛋白質(zhì)BSA的吸附量，進一步說明在Fe3O4@BHb-MIPs形成的過程中，印跡薄層上形成了對BHb具有特異性結合能力的作用位點。印跡因子和選擇性因子分別為3.50和2.92。將其應用于實際牛血樣品中，表現(xiàn)出對牛血中的BHb有良好的特異性識別能力。

本實驗制備方法簡單，條件溫和。制得的分子印跡磁性納米?？梢栽谕饧哟艌鲎饔孟?，實現(xiàn)快速分離，后處理過程簡單。采用透射電鏡和磁滯回線對制備的納米材料進行了表征分析。通過動力學吸附、等溫吸附、選擇性吸附實驗等考察了分子印跡磁性納米粒的吸附和識別性能。結果顯示，所得分子印跡磁性納米粒不僅具有良好的形貌和超順磁性，還有快的動力學吸附速率、高的吸附量、良好的選擇性。實際樣品分析實驗證明該印跡材料為目標蛋白質(zhì)的分離純化提供了一種新的可行方法。

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Preparationandapplicationofmagneticmolecularlyimprintednanoparticlesforseparationandpurificationofprotein

TANG Xiao-shuang1, WANG Li1, WANG Si-cen2
(1. the Second Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University 710004; 2. College of Pharmacy, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo develop a novel strategy for separation and purification of target protein by magnetic molecularly imprinted nanoparticles.MethodsFe3O4nanoparticles were synthesized through a hydrothermal method. A sol-gel technique was adopted to prepare imprinting layers. The adsorption capability of magnetic molecularly imprinted nanoparticles was investigated by kinetic, isothermal, and selective binding experiments.ResultsThe imprinted nanomaterials could reach equilibrium within 30 min. The adsorption capacity was 44.51 mg/g. The imprinting factor and selectivity coefficient were 3.50 and 2.92, respectively. The resulting imprinted polymers could selectively separate and enrich bovine hemoglobin from a bovine blood sample.ConclusionThe prepared imprinted nanomaterials with good specific adsoprtion ability can provide an effective strategy for separation and purification of target protein.

protein; separation; purification; molecularly imprinted polymer

2017-08-29

2017-11-08

國家自然科學基金青年科學基金項目(No.81701830)，陜西省自然科學基礎研究計劃青年項目(No.2017JQ8052)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81701830) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2017JQ8052)

唐驍爽，助理研究員，博士. E-mail: tangxiaos@sina.com

優(yōu)先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171205.1808.028.html(2017-12-05)

R313

A

10.7652/jdyxb201801027

(編輯 卓選鵬)