蔣 潔，張彥兵，宗 偉，曹 菲，韓 亮(. 陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 70068；. 陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 7006；. 陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，陜西西安 70068；. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 7006)

血紅素加氧酶-1在胃癌順鉑化療敏感性中的作用

蔣 潔1，張彥兵2，宗 偉3，曹 菲1，韓 亮4
(1. 陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710068；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；3. 陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，陜西西安 710068；4. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

目的研究血紅素加氧酶-1(HO-1)及其抑制劑在胃癌順鉑(CDDP)化療中的作用，為胃癌化療敏感性提供潛在的增敏靶點(diǎn)。方法MTT法檢測(cè)鋅原卟啉IX (ZnPPIX)及CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖能力的影響；Western blot和Real-time PCR分別檢測(cè)胃癌細(xì)胞中HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)；構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型并進(jìn)一步觀察ZnPPIX 及CDDP對(duì)胃癌成瘤能力的影響。結(jié)果CDDP聯(lián)合ZnPPIX干預(yù)胃癌細(xì)胞明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖率(P<0.05)；同時(shí)，CDDP胃癌細(xì)胞中HO-1 mRNA水平和蛋白的表達(dá)增加(P<0.05)。而CDDP聯(lián)合ZnPPIX干預(yù)細(xì)胞組的HO-1的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDDP可抑制胃癌皮下種植瘤的生長(zhǎng)，腫瘤體積和質(zhì)量明顯降低。結(jié)論HO-1抑制劑ZnPPIX可增強(qiáng)CDDP對(duì)胃癌的化療敏感性，有可能成為潛在的胃癌CDDP化療方案的增敏劑。

胃癌；順鉑(CDDP)；血紅素加氧酶-1(HO-1)；鋅原卟啉IX (ZnPPIX)；化療敏感性

血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)又稱熱休克蛋白32，是催化血紅素氧化降解的起始酶和限速酶，參與體內(nèi)多種抗炎及抗氧化過(guò)程[1-2]，與惡性腫瘤凋亡、免疫逃逸和氧化應(yīng)激等都有密切關(guān)系[3]。HO-1高表達(dá)也可能與腫瘤預(yù)后不良、轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥相關(guān)[4-5]。HO-1發(fā)揮活性的作用底物本質(zhì)上是鐵原卟啉(FePP)，而鋅原卟啉IX(ZnPPIX)作為HO-1的特異性抑制劑，能夠明顯抑制HO-1的表達(dá)[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道，鋅原卟啉可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的化療敏感性[8-9]。HO-1在胃癌組織中表達(dá)升高[10]。逐步深入的相關(guān)研究顯示，ZnPPIX通過(guò)抑制血管發(fā)生而抑制胃癌裸鼠移植瘤模型的生長(zhǎng)[11-12]。目前，關(guān)于鋅原卟啉對(duì)胃癌細(xì)胞的研究較少。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)HO-1抑制劑ZnPPIX對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力具有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)探討HO-1及其抑制劑ZnPPIX對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901化療敏感性的影響，并初步觀察順鉑(cisplatin, CDDP)與HO-1的相互作用，分別從細(xì)胞水平及動(dòng)物模型中觀察胃癌生長(zhǎng)能力的變化。

1 材料與方法

1.1材料人胃癌細(xì)胞株SGC7901由本實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；HO-1抑制劑ZnPPIX、內(nèi)參GAPDH抗體以及二抗(Abcom及Santa Cruz公司)。常規(guī)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)SGC7901，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖能力活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT(噻唑藍(lán))還原，形成不溶于水的藍(lán)紫色針狀結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，DMSO可溶解這種藍(lán)紫色結(jié)晶，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸光度值以間接反映活細(xì)胞數(shù)量。為了證明HO-1和CDDP在胃癌化療中的作用，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、CDDP組(5 μg/mL)、ZnPPIX組(100 μmol/L)和CDDP聯(lián)合ZnPPIX組。將8×103個(gè)腫瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，各組分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入MTT溶液培養(yǎng)，棄去原液，每孔加入DMSO，置于搖床上低速振蕩；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值。計(jì)算平均增殖率，增殖率=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值。

1.3Westernblot檢測(cè)胃癌細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、CDDP組(5 μg/mL)、ZnPPIX組(100 μmol/L)和CDDP聯(lián)合ZnPPIX組。干預(yù)48 h，加入細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。將20 μL樣品依次加入制好的120 g/L SDS-PAGE膠中電泳后，采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜1 h。TBST洗膜2次后加入HO-1一抗(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。再次洗膜2次加入二抗(1∶1 000)常溫孵育2 h。洗膜后暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影后應(yīng)用凝膠顯影系統(tǒng)拍照并分析蛋白表達(dá)水平。

1.4Real-timePCR檢測(cè)HO-1mRNA的表達(dá)變化分組同1.3，分別作用48 h，參照操作說(shuō)明提取各組細(xì)胞DNA。HO-1 mRNA引物序列分別為CAGGCAGAGGGTGATAGAAGAGG，CTGGGAGCG-GGTGTTGAGTG；GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，引物序列分別為ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG，AG-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。Real-time PCR反應(yīng)條件：95.0 ℃預(yù)變性1 min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)(95.0 ℃變性15 s；55.0 ℃退火15 s；72.0 ℃延伸45 s)。瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算機(jī)對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描分析(Gel Works分析)，HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量=HO-1 mRNA吸光度/內(nèi)參GAPDH吸光度。

1.5荷瘤裸鼠模型的構(gòu)建篩選生長(zhǎng)狀況良好的6周齡雌性裸鼠，每只裸鼠體質(zhì)量20 g左右。胃癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為108/mL。微量注射器吸取單細(xì)胞懸液0.1 mL，水平20°進(jìn)針注射入裸鼠臀部皮下。荷瘤裸鼠模型構(gòu)建7 d進(jìn)行分組，為空白對(duì)照組、CDDP組、CDDP聯(lián)合ZnPPIX組和ZnPPIX組，腹腔注射藥物干預(yù)，給藥劑量分別為CDDP 25 mg/kg、ZnPPIX 5 mg/kg，間日給藥。觀察裸鼠及腫瘤生長(zhǎng)情況，術(shù)后21 d測(cè)量腫瘤重量，統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1HO-1抑制劑增強(qiáng)CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用MTT檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，在各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，CDDP與對(duì)照組相比，均能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)。CDDP(5 μg/mL)聯(lián)合應(yīng)用ZnPPIX(100 μmol/L)組更明顯地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而單獨(dú)應(yīng)用ZnPPIX組的細(xì)胞增殖抑制程度與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其增殖抑制率明顯低于CDDP或聯(lián)合干預(yù)組。

2.2各組細(xì)胞HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CDDP組胃癌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而作為HO-1特異性抑制劑的ZnPPIX作用時(shí)，胃癌細(xì)胞中HO-1的表達(dá)明顯抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CDDP聯(lián)合ZnPPIX干預(yù)細(xì)胞組中HO-1的表達(dá)較對(duì)照組及CDDP組減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。這說(shuō)明CDDP可促進(jìn)胃癌細(xì)胞HO-1表達(dá)增高，而這種促進(jìn)作用可被ZnPPIX有效逆轉(zhuǎn)。提示HO-1在胃癌CDDP化療中有重要作用。

圖1HO-1抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞CDDP化療敏感性的影響

Fig.1 Effects of ZnPPIX on the chemosensitivity of gastric cancer cells

與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05。

圖2CDDP對(duì)胃癌細(xì)胞中HO-1表達(dá)的影響

Fig.2 Effects of CDDP on the expression of HO-1 in gastric cancer cells

A：mRNA的表達(dá)情況比較；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果。與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；與CDDP組比較，#P<0.05。

2.3CDDP聯(lián)合ZnPPIX抑制皮下種植瘤的生長(zhǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示，對(duì)照組平均瘤重1.51 g，CDDP組0.90 g，CDDP聯(lián)合ZnPPIX組0.53 g，單獨(dú)應(yīng)用ZnPPIX組1.34 g。CDDP較對(duì)照組抑制胃癌種植瘤的生長(zhǎng)，而CDDP聯(lián)合ZnPPIX組較對(duì)照組及CDDP組顯著抑制了腫瘤的增長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而單獨(dú)應(yīng)用ZnPPIX組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？梢?jiàn)HO-1抑制劑ZnPPIX在胃癌CDDP化療中起到明顯的增敏作用。

圖3HO-1抑制劑對(duì)裸鼠胃癌皮下種植瘤CDDP化療敏感性的影響

Fig.3 Effects of ZnPPIX on the chemosensitivity in nude mice

A：裸鼠皮下成瘤后的腫瘤形態(tài)；B：統(tǒng)計(jì)分析各組種植瘤瘤體質(zhì)量。與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；與CDDP組比較，#P<0.05。

3 討 論

HO-1是血紅素分解代謝的關(guān)鍵限速酶，是HO家族中的一員，在多種腫瘤組織中的表達(dá)升高，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HO-1在胃癌的進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色[13-14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HO-1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲有促進(jìn)作用，而其抑制劑ZnPPIX可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)活性。

CDDP屬于胃癌化療的經(jīng)典藥物。有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤進(jìn)展及治療中，CDDP化療機(jī)制涉及到HO-1及其通路分子，并增強(qiáng)其化療敏感性[15-18]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們探討HO-1及其抑制劑ZnPPIX對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901化療敏感性的影響，并探究CDDP對(duì)HO-1表達(dá)的影響，從細(xì)胞學(xué)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面進(jìn)一步驗(yàn)證課題假設(shè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZnPPIX可增強(qiáng)CDDP對(duì)胃癌的化療作用，并且在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CDDP可明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞HO-1的表達(dá)，而應(yīng)用ZnPPIX可明顯逆轉(zhuǎn)這種促進(jìn)作用。故得出HO-1抑制劑通過(guò)增敏CDDP的化療效果發(fā)揮作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型，應(yīng)用不同藥物干預(yù)裸鼠后發(fā)現(xiàn)，CDDP聯(lián)合ZnPPIX后顯著抑制了胃癌皮下種植瘤的增長(zhǎng)能力，從而在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證了體外研究結(jié)果。

然而，胃癌的化療過(guò)程和機(jī)制較為復(fù)雜。藥物的聯(lián)合應(yīng)用、藥物的劑量、給藥的途徑和給藥方式，都能夠影響到化療藥物對(duì)胃癌的治療效果，所以應(yīng)用CDDP單藥模擬胃癌化療過(guò)程具有一定局限性。本課題主要研究HO-1抑制劑對(duì)CDDP化療的增敏作用，故應(yīng)用單藥化療方案。在后期的研究中，仍需將理想的模擬人體胃癌化療過(guò)程作為建模目標(biāo)。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究中CDDP可影響HO-1的表達(dá)，但其內(nèi)在機(jī)制如何，在后期的實(shí)驗(yàn)中仍需進(jìn)一步論證及闡明。本課題中，ZnPPIX可逆轉(zhuǎn)CDDP對(duì)HO-1的促進(jìn)作用，而不是抵消此種促進(jìn)作用，其中量效關(guān)系在下一步實(shí)驗(yàn)中仍需探討。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作為體外實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充性論證，在觀察胃癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤的過(guò)程中，各干預(yù)組藥物在體內(nèi)的代謝及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生影響的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)行病理和生化相關(guān)研究。

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Effectsofhemeoxygenase-1oncisplatinchemosensitivityingastriccancer

JIANG Jie1, ZHANG Yan-bing2, ZONG Wei3, CAO Fei1, HAN Liang4
(1. Department of Medical Oncology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068; 2. Department of Medical Oncology, Shaanxi Provincial Tumor Hospital, Xi’an 710061;3. the First Department of Gastroenterology, Shaanxi Provincial People’s Hospital,Xi’an 710068; 4. Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo explore the roles of heme oxygenase-1 (HO-1) and protoporphyrin zinc IX (ZnPPIX), its inhibitor, in cisplatin chemotherapy for gastric cancer so as to provide potential targets for chemosensitivity in gastric cancer.MethodsGastric cancer cell line SGC7901 was usedinvitro. MTT assay was carried out to determine the effects of ZnPPIX and CDDP on the proliferation in gastric cancer cells. The expression of HO-1 in gastric cancer cells was measured by Real-time PCR and Western blot, respectively. The gastric cancer xenografts in nude mice were used to study the effects of ZnPPIX and CDDP in gastric cancer on tumor formationinvivo.ResultsThe proliferation of cancer cells, interfered by CDDP in combination with ZnPPIX, could be significantly inhibited (P<0.05). Moreover, CDDP could increase the expression of HO-1 in gastric cancer cells, which was reversed by ZnPPIX (P<0.05). The animal experiment showed that CDDP could inhibit gastric cancer growth in nude mice and reduce tumor volume and weight.ConclusionZnPPIX could enhance the chemosensitivity of CDDP in gastric cancer, which may be a potential sensitizer of cisplatin-based chemotherapy in gastric cancer.

gastric cancer; cisplatin (CDDP); heme oxygenase-1 (HO-1); protoporphyrin zinc IX (ZnPPIX); chemosensitivity

2017-04-19

2017-07-03

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014JM4141)

Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2014JM4141)

韓亮，主治醫(yī)師. E-mail: hanliangxjtu@163.com.

優(yōu)先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171204.1755.018.html(2017-12-04)

R735.2

A

10.7652/jdyxb201801012

(編輯 國(guó) 榮)