武麗濤，孫 娟，王愉涵，郭進露，劉 艷，杜小娟，閆小飛，張富軍，李冬民(西安交通大學：1. 醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系；2. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室；. 201級臨床醫(yī)學五年制，陜西西安 710061 )

二甲雙胍對D-氨基半乳糖聯(lián)合Pam3CSK4誘導的SD大鼠的急性肝損傷及炎癥反應(yīng)的作用及機制

武麗濤1,2，孫 娟3，王愉涵3，郭進露3，劉 艷3，杜小娟1,2，閆小飛1,2，張富軍1,2，李冬民1,2
(西安交通大學：1. 醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系；2. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室；3. 2013級臨床醫(yī)學五年制，陜西西安 710061 )

目的研究二甲雙胍在D-氨基半乳糖聯(lián)合Pam3CSK4(以下簡稱DP)誘導的SD大鼠急性肝損傷動物模型中的抗損傷及抗炎作用。方法選取18只雄性SD大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(350 mg/kg)和Pam3CSK4(50 μg/kg)混合液構(gòu)建急性肝損傷大鼠模型，干預組大鼠分別給予PBS與二甲雙胍。分別稱量大鼠肝重、體質(zhì)量并評估肝/體質(zhì)量比變化；通過HE染色觀察大鼠肝臟病理改變；收集大鼠空腹血清用于檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)水平；同時通過ELISA與RT-qPCR檢測肝組織中促炎因子(IL-6與TNF-α)的表達水平；最后通過Western blotting檢測大鼠肝臟中MAPK信號通路的活化情況。結(jié)果與對照組相比，兩干預組的肝重比、血清轉(zhuǎn)氨酶以及促炎因子IL-6與TNF-α的表達水平均顯著升高；同時肝細胞水樣變性與肝間質(zhì)滲出表明DP成功構(gòu)建了SD大鼠急性肝損傷模型。與PBS干預組相比，二甲雙胍干預組肝重比降低，肝細胞損傷明顯減輕；血清轉(zhuǎn)氨酶與促炎因子的表達水平均顯著下降；同時肝組織中p-ERK1/2、p-SAPK/JNK、p-P38 MAPK的蛋白表達降低，提示二甲雙胍可能通過抑制MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用。結(jié)論二甲雙胍在DP成功誘導的SD大鼠急性肝損傷動物模型中減輕了炎癥反應(yīng)。

D-氨基半乳糖；Pam3CSK4；二甲雙胍；急性肝損傷；炎癥

長期以來，肝臟疾病一直是人類健康所面臨的一大難題。其中，急性肝損傷是指在無慢性肝病史的基礎(chǔ)上，由各種病因?qū)е麓罅扛渭毎麚p傷及肝功能障礙的現(xiàn)象，它是急性肝功能衰竭的基礎(chǔ)，臨床死亡率較高且并無特異性治療方案[1]。肝細胞損傷所引起的功能性障礙較為普遍，而有效的急性肝損傷實驗動物模型的建立不但對其發(fā)病機制的研究十分重要，而且對肝細胞損傷治療藥物的高效篩選尤為重要。本文利用D-氨基半乳糖和Pam3CSK4聯(lián)合(以下簡稱DP)誘導建立了一種急性肝損傷大鼠模型，模擬腸源性內(nèi)毒素血癥造成原發(fā)性肝損傷，是目前較為公認的急性肝損傷動物模型之一[2-3]。

雙胍藥物二甲雙胍是臨床上用于治療2型糖尿病的一線常用藥[4]，同時二甲雙胍還用于治療諸如多囊卵巢綜合征、肥胖、心力衰竭和高血壓等病癥。最近，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍具有肝保護作用：可以改善非酒精性脂肪性肝炎癥狀[5]，預防酒精誘導的肝損傷[6]，并且保護動物免受CCl4或甲氨蝶呤誘導的肝毒性[7-8]。然而，二甲雙胍對DP聯(lián)合誘導的急性肝損傷的作用尚未見報道。本研究主要探討了二甲雙胍對DP的急性肝損傷大鼠抗炎及抗損傷作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器實驗動物：本實驗選用18只4～6周齡SPF級健康雄性SD大鼠，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，在生物化學與分子生物學系SPF級動物實驗室開展實驗，室溫23～26 ℃，相對濕度50%～70%。分籠飼養(yǎng)，每籠3只，給予滅菌處理過的飼料和飲用水。

主要試劑：D-氨基半乳糖(G1639，美國Sigma公司)，Pam3CSK4(Bio Vision公司)；Rat TNF-α與Rat IL-6 ELISA試劑盒(Peprotech公司)；Peroxidase-conjugated Strptavidin (Jackson Immuno Research公司)；Trizol?試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis (Fermentas)；MAPK家族抗體試劑盒(CST)。其余試劑均按照分子克隆實驗指南(第3版)的實驗方法配制。

主要儀器：電子天平(ES-500E)、實時定量PCR儀(安捷倫，Mx3005P)、全波長酶標儀(Thermo Electron Corporation，Mutiskan Spectrum)、高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)、手握式勻漿器(Eppendorf，德國)、石蠟組織切片機(Leica RM22350)、蛋白電泳設(shè)備(Bio-rad公司)、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)、超純水機(Millipore，美國)等。

1.2實驗方法

1.2.1模型的構(gòu)建與取材 18只雄性SD大鼠平均分成3個實驗組：對照組、PBS+DP組、二甲雙胍+DP組，每組6只。分別腹腔注射等體積無菌PBS、PBS以及二甲雙胍(400 mg/kg)[9]預處理6 h，隨后將D-氨基半乳糖和Pam3CSK4加入PBS中配制成混合溶液，按350 mg/kg D-氨基半乳糖和50 μg/kg Pam3CSK4[10]的劑量分別腹腔注射PBS+DP組、二甲雙胍+DP組模型大鼠，同時對照組給予等體積無菌PBS，繼續(xù)作用12 h。SD大鼠急性肝損傷模型構(gòu)建成功后，用100 g/L的水合氯醛成功麻醉動物，無菌條件下打開腹腔，腹主動脈取血，靜置于1.5 mL EP管20 min后，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。完整取下肝臟，觀察其表觀變化并稱重；統(tǒng)一取肝左葉置于40 g/L多聚甲醛固定液，固定24 h以上后經(jīng)過石蠟包埋制備肝組織切片；剩余肝組織置于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2肝重比指數(shù) 完整取下大鼠肝臟并稱重，肝重比指數(shù)=肝臟重量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)，獲得其肝重比進行組間比較。

1.2.3血清學指標的檢測 模型大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的濃度使用全自動生物化學分析儀測量。血清中促炎因子IL-6以及TNF-α的表達水平分別使用Rat IL-6 ELISA Development Kit和Rat TNF-α ELISA Development Kit，按照Peprotech公司說明書提供的ELISA操作方法檢測。

1.2.4肝組織病理學檢測 取成功固定、部位相同的肝臟組織少許制備石蠟切片，進行HE染色，鏡下觀察肝臟組織病理變化，包括肝細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及肝小葉等的改變，使用顯微鏡進行拍照分析。

1.2.5Real time-qPCR 使用RT-qPCR來研究大鼠肝臟組織中促炎因子IL-6、TNFα的mRNA表達水平。使用Trizol?試劑提取SD大鼠肝臟組織總RNA，取5 μg使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)成cDNA。以cDNA為模板通過SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ進行Real time-qPCR反應(yīng)。其中，總RNA的提取，cDNA的合成及PT-qPCR的操作參照本課題組前期文獻所述的方法進行[11]。相關(guān)引物序列信息見表1。

表1RT-qPCR引物序列

Tab.1 Primers sequence for RT-qPCR

基因上游序列下游序列TNF?αTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTTGGTGGTTTGCTACGACGTGIL?6TTCTTGGGACTGATGCTGCTGGCTTTGTCTTTCTTGTTβ?actinGAGGGAAATCGTGCGTGACGCATCGGAACCGCTCATT

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷大鼠肝臟形態(tài)的影響經(jīng)水合氯醛成功麻醉SD大鼠，打開腹腔后肉眼觀察兩組大鼠肝臟的大體形態(tài)。與對照組相比，PBS+DP實驗組肝臟腫脹且顏色暗淡(圖1A)。肝重比值顯示(圖1B)，經(jīng)DP處理12 h后，SD大鼠的肝重比明顯高于正常對照組，單因素方差分析結(jié)果為P<0.001，差異具有顯著性，說明肝臟顯著受損，模型構(gòu)建成功。與PBS+DP模型組相比，二甲雙胍+DP組在一定程度上緩解了肝臟腫脹，其肝重比指數(shù)與模型組分析結(jié)果為P=0.010，表明二甲雙胍可改善肝臟損傷，且差異具有顯著性(n=6，F(xiàn)=19.000)。

2.2二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷大鼠肝臟病理學的影響將各實驗組肝臟組織包埋制備成石蠟切片，利用HE染色分析肝臟組織病理改變。結(jié)果如圖2所示，對照組大鼠肝臟細胞形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，肝索排列均勻，小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見損傷病理改變(圖2A)。與對照組相比，經(jīng)DP誘導12 h后，SD大鼠肝臟組織細胞核質(zhì)比變大，細胞核深染，并且在40倍鏡下可見不同程度的空泡狀病變、水樣變性及灶狀壞死(圖2B)。與PBS+DP模型組相比，二甲雙胍+DP治療組肝細胞排列基本有序，空泡病變和灶狀壞死得到了明顯改善(圖2C)。因此，二甲雙胍對DP所致的急性肝損傷有明顯改善作用(n=6)。

圖1二甲雙胍改善了DP誘導的急性肝損傷大鼠肝臟形態(tài)的損傷

Fig.1 Metformin ameliorated liver injury induced by D-galactosamine combined with Pam3CSK4 in SD rats

A：SD大鼠肝臟表觀形態(tài)；B：急性肝損傷大鼠肝重比。

2.3二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響利用全自動生化分析儀檢測模型大鼠血清中ALT及AST的表達水平，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，經(jīng)DP處理12 h后，SD大鼠血清中ALT水平顯著升高，單因素方差分析結(jié)果為P<0.001，差異具有顯著性，AST水平也有明顯升高，分析結(jié)果P=0.021(圖3A、B)。這些指標反映了PBS+DP模型組大鼠肝臟功能出現(xiàn)紊亂。與PBS+DP模型組相比，二甲雙胍+DP治療組ALT表達水平單因素方差分析結(jié)果P=0.015，AST表達水平單因素方差分析結(jié)果P=0.366，表明二甲雙胍降低了急性肝損傷大鼠血清中各項轉(zhuǎn)氨酶的表達水平，且差異均具有統(tǒng)計學意義(n=6，ALT水平統(tǒng)計中F=36.594；AST水平統(tǒng)計中F=3.382)。

圖2二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷SD大鼠肝組織病理學的影響

Fig.2 Effects of metformin on liver tissues of SD rats with acute hepatic injury induced by D-galactosamine and Pam3CSK4 (HE, ×400)

A：對照組肝組織；B：PBS+DP模型組肝組織；C：二甲雙胍+DP治療組肝組織。

圖3二甲雙胍降低了DP誘導的急性肝損傷SD大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的表達水平

Fig.3 Metformin decreased the serum level of serum transaminase in SD rats with acute hepatic injury induced by D-galactosamine and Pam3CSK4

A：急性肝損傷大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶ALT的表達水平；B：急性肝損傷大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶AST的表達水平。

2.4二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷大鼠體內(nèi)促炎因子表達水平的影響為了檢測二甲雙胍是否通過改變模型大鼠體內(nèi)炎性因子的表達來影響SD大鼠對D-氨基半乳糖和Pam3CSK4的敏感性，我們分別通過ELISA和RT-qPCR檢測模型大鼠體內(nèi)促炎因子TNF-α與IL-6的表達水平。ELISA結(jié)果如圖4A、B所示，與對照組相比，經(jīng)DP誘導12 h后，PBS+DP模型組大鼠血清中IL-6的表達水平顯著升高，而且表達量高出對照組3～4倍。單因素方差分析結(jié)果為P<0.001，差異具有顯著性；同時，TNF-α的表達水平也有明顯升高，分析結(jié)果P<0.001。經(jīng)二甲雙胍預保護組，顯著降低了促炎因子IL-6的表達水平，單因素方差分析結(jié)果顯示P<0.001，差異具有顯著性；單因素方差分析TNF-α的表達水平的降低量顯示P<0.001，差異也具有顯著性。我們進一步用RT-qPCR檢測了大鼠肝臟組織中促炎因子IL-6與TNF-α的mRNA表達水平，結(jié)果如圖4C、D所示。與對照組相比，經(jīng)DP誘導的模型組，單因素方差分析IL-6的mRNA表達水平，結(jié)果顯示P<0.001，差異具有顯著性且高于對照組2～3倍。同時TNF-α的表達水平分析結(jié)果為P<0.001，差異同樣具有顯著性。而經(jīng)過二甲雙胍預處理的實驗組，顯著降低了促炎因子IL-6的mRNA表達水平，單因素方差分析結(jié)果為P<0.001，同時TNF-α的mRNA表達水平的降低量為P=0.001，顯示差異均具有統(tǒng)計學意義(n=6，其中，IL-6血清表達水平統(tǒng)計中F=14.457；TNF-α血清表達水平統(tǒng)計中F=66.612；IL-6的肝組織mRNA表達水平統(tǒng)計中F=51.702；TNF-α肝組織mRNA表達水平統(tǒng)計中F=20.772)。以上結(jié)果表明，二甲雙胍在DP誘導的SD大鼠急性肝損傷模型中具有明顯的抗炎作用。

圖4二甲雙胍降低了DP誘導的急性肝損傷SD大鼠體內(nèi)促炎因子的表達水平

Fig.4 Metformin decreased the expressions of pro-inflammatory cytokines in SD rats with acute hepatic injury induced by D-galactosamine and Pam3CSK4

A：急性肝損傷大鼠血清中促炎因子IL-6的表達水平；B：急性肝損傷大鼠血清中促炎因子TNF-α的表達水平；C：急性肝損傷大鼠肝臟中促炎因子IL-6的mRNA表達水平；D：急性肝損傷大鼠肝臟中促炎因子TNF-α的mRNA表達水平。

2.5二甲雙胍對DP誘導的急性肝損傷大鼠肝臟內(nèi)MAPK信號通路的影響內(nèi)毒素引發(fā)肝臟巨噬細胞的炎癥反應(yīng)主要依賴MAPK炎癥信號通路。為了研究二甲雙胍是否可以通過抑制MAPK信號通路活化來影響炎癥反應(yīng)，我們利用Western blot檢測了大鼠肝臟組織中MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達，包括p-ERK1/2、ERK；p-SAPK/JNK、SAPK/JNK；p-P38 MAPK、P38 MAPK。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)DP誘導12 h后，PBS+DP模型組大鼠肝組織蛋白質(zhì)p-ERK1/2、p-SAPK/JNK、p-P38 MAPK的表達量均顯著高于對照組，表明DP誘導活化了MAPK炎癥信號通路，引起大鼠肝臟炎癥反應(yīng)。經(jīng)過二甲雙胍預保護，p-ERK1/2、p-SAPK/JNK、p-P38 MAPK的表達量均有不同程度的降低，其中尤以p-P38 MAPK的降低量最明顯，這也進一步表明了二甲雙胍通過抑制MAPK信號通路活化來抑制DP誘導的急性肝損傷SD大鼠的炎癥反應(yīng)。

圖5二甲雙胍抑制了DP誘導的急性肝損傷SD大鼠肝臟MAPK信號通路的活化

Fig.5 Metform ininhibited the activation of MAPK signaling pathway in the liver of SD rats with acute hepatic injury induced by D-galactosamine and Pam3CSK4

Western blot檢測急性肝損傷大鼠肝臟組織蛋白中MAPK信號通路的活化情況，其中泳道1、2、3分別為：正常對照組、PBS+DP模型組及二甲雙胍+DP治療組。

3 討 論

急性肝損傷主要是由病毒感染、用藥或飲食不當、乙醇攝入過量以及放射性元素損傷等因素引起的肝臟功能異常，它是急性肝功能衰竭的基礎(chǔ)。目前常見的肝損傷動物模型有四氯化碳、二甲基亞硝胺、D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺、四環(huán)素、對乙酰氨基酚、異煙肼、環(huán)孢素A以及雷公藤等所誘導的大鼠或小鼠的急慢性肝損傷動物模型[1]。本研究采用DP共同作用致敏SD大鼠構(gòu)建急性肝損傷動物模型。D-半乳糖胺是一種氨基糖，是肝細胞磷酸尿苷干擾劑，可競爭UTP生成二磷酸尿苷半乳糖，使磷酸尿苷耗竭，肝細胞合成蛋白質(zhì)減少。同時，D-半乳糖胺可與肝實質(zhì)細胞特異性結(jié)合，影響其完整性，而使得肝細胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，激活細胞內(nèi)磷脂酶、核酶并引起細胞內(nèi)自由基的生成增多，從而直接導致肝實質(zhì)細胞的破裂損傷[12]。Pam3CSK4是一種合成的三酰脂肽，是模擬細菌LPS的酰化氨基端。它是TLR2的人工配體，TLR2能夠與二酯酰脂蛋白結(jié)合而激活TLR2信號通路，促進肝臟中Kupffer細胞[13]及肝星狀細胞[14]合成、下游IL-6與TNF-α等炎性細胞因子的表達上調(diào)[15]。其中TNF-α可引起肝細胞凋亡及炎性浸潤，從而進一步加重肝細胞損傷[16]。DP所引起的急性肝損傷屬于免疫性損傷，主要以激活單核-巨噬細胞，釋放大量炎性因子，并且D-半乳糖胺所引起的肝細胞彌漫性損傷會大大降低肝細胞對脂多糖的解毒能力[17]，從而增強Pam3CSK4的肝毒性。所以，本研究選用這兩種藥物聯(lián)合致敏SD大鼠急性肝損傷的產(chǎn)生。

肝臟表觀形態(tài)結(jié)合組織病理學檢測結(jié)果可以直觀判斷肝臟損傷程度。對比肝損傷模型組與二甲雙胍治療組，我們可以發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以明顯改善肝臟的色澤，肝細胞空泡變性減少，壞死程度減輕，從而改善DP誘導的肝損傷。肝細胞損傷會引起肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的升高，轉(zhuǎn)氨酶的表達水平與急性壞死炎性肝臟疾病的程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Pam3CSK4(50 μg/kg)在12 h內(nèi)可引起D-氨基半乳糖所引起的SD大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的表達水平升高，而二甲雙胍預保護實驗組中，大鼠血清中ALT、AST表達水平則顯著下降。因而從轉(zhuǎn)氨酶水平的改變可知，二甲雙胍可減輕DP誘導的急性肝損傷程度。

肝細胞損傷會產(chǎn)生并釋放大量炎性因子，導致肝細胞結(jié)構(gòu)損傷、壞死，甚至纖維化[18]。因此，本研究中我們分別通過ELISA與RT-qPCR的方法檢測了模型大鼠血清與肝臟組織中炎性因子的表達水平。結(jié)果顯示：在正常生理水平條件下，IL-6與TNF-α的表達水平較低；肝損傷模型組中，DP可顯著調(diào)高IL-6與TNF-α的表達水平；而經(jīng)過二甲雙胍預保護6 h，則顯著減輕了模型大鼠體內(nèi)的炎癥水平。

MAPK是脂多糖誘發(fā)肝臟巨噬細胞炎性反應(yīng)的主要信號通路。本實驗中我們通過Western blot檢測了SD大鼠肝組織蛋白中ERK1/2、p-ERK1/2；p-SAPK/JNK；P38 MAPK、p-P38 MAPK的表達情況。結(jié)果顯示，相比于正常對照組，DP可明顯引起MAPK信號通路的磷酸化，而經(jīng)過二甲雙胍治療后，MAPK信號通路的活化情況得到改善，尤其以p-P38 MAPK的改善水平最為明顯，表明在DP誘導的急性肝損傷模型中，二甲雙胍通過抑制MAPK信號通路的活化起到抗炎作用。

綜上所述，二甲雙胍在DP誘導的急性肝損傷模型中，通過抑制MAPK信號通路的活化，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制促炎因子的產(chǎn)生，從而改善肝臟的損傷與炎癥。為闡明二甲雙胍在急性肝臟炎癥中的作用提供了理論與實驗依據(jù)，為急性肝損傷的臨床治療提供了新思路。

[1] BERNAL W, AUZINGER G, DHAWAN A, et al. Acute liver failure[J]. Lancet, 2010, 376(9736):190-201.

[2] LIU Y, PAN X, LI S, et al. Endoplasmic reticulum stress restrains hepatocyte growth factor expression in hepatic stellate cells and rat acute liver failure model[J]. Chem Biol Interact, 2017, 277:43-54.

[3] LI Y, LU L, LUO N, et al. Inhibition of PI3K/AKt/mTOR signaling pathway protects against d-galactosamine/lipopolysaccharide-induced acute liver failure by chaperone-mediated autophagy in rats[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 92:544-553.

[4] SAISHO Y. Metformin and inflammation: Its potential beyond glucose-lowering effect[J]. Endocr, Metab & Immune Disord Drug Targets, 2015, 15(3):196-205.

[5] NAYAK IMN, NARENDAR K, M PA, et al. Comparison of pioglitazone and metformin efficacy against glucocorticoid induced atherosclerosis and hepatic steatosis in insulin resistant rats[J]. J Clin Diagn Res, 2017, 11(7):FC06-FC10.

[6] BERGHEIM I, GUO L, DAVIS MA, et al. Metformin prevents alcohol-induced liver injury in the mouse: Critical role of plasminogen activator inhibitor-1[J]. Gastroenterology, 2006, 130(7):2099-2112.

[7] FAN K, WU K, LIN L, et al. Metformin mitigates carbon tetrachloride-induced TGF-β1/Smad3 signaling and liver fibrosis in mice[J]. Biomed & Pharmacother, 2017, 90:421-426.

[8] HADI NR, AL-AMRAN FG, SWADI A. Metformin ameliorates methotrexate-induced hepatotoxicity[J]. J Pharmacol Pharmacother, 2012, 3(3):248-253.

[9] YUAN H, LI L, ZHENG W, et al. Antidiabetic drug metformin alleviates endotoxin-induced fulminant liver injury in mice[J]. Int Immunopharmacol, 2012, 12(4):682-688.

[10] DE NARDO D, LABZIN LI, KONO H, et al. High-density lipoprotein mediates anti-inflammatory reprogramming of macrophages via the transcriptional regulator ATF3[J]. Nature, 2014, 15(2):152-160.

[11] LI D, WANG X, LAN X, et al. Down-regulation of miR-144 elicits proinflammatory cytokine production by targeting toll-like receptor 2 in nonalcoholic steatohepatitis of high-fat-diet-induced metabolic syndrome E3 rats[J]. Mol Cell Endocrinol, 2015, 402:1-12.

[12] SILVERSTEIN R. D-galactosamine lethality model: Scope and limitations[J]. J Endotoxin Res, 2004, 10(3):147-162.

[13] HOFFMANN F, SASS G, ZILLIES J, et al. A novel technique for selective NF-kappaB inhibition in Kupffer cells: Contrary effects in fulminant hepatitis and ischaemia-reperfusion[J]. Gut, 2009, 58(12):1670-1678.

[14] THIRUNAVUKKARASU C, UEMURA T, WANG LF, et al. Normal rat hepatic stellate cells respond to endotoxin in LBP-independent manner to produce inhibitor(s) of DNA synthesis in hepatocytes[J]. J Cell Physiol, 2005, 204(2):654-665.

[15] ZHOU M, ZHU X, YE S, et al. Blocking TLR2 in vivo attenuates experimental hepatitis induced by concanavalin A in mice[J]. Int Immunopharmacol, 2014, 21(1):241-246.

[16] LIU QS, CHENG ZW, XIONG JG, et al. Erythropoietin pretreatment exerts anti-inflammatory effects in hepatic ischemia/reperfusion-injured rats via suppression of the TLR2/NF-κB pathway[C]. Transplant Proc Elsevier, 2015, 47(2):283-289.

[17] WANG X, ZHANG L, WEI Z, et al. The inhibitory action of PDCD4 in lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced acute liver injury[J]. Lab Invest, 2013, 93(3):291.

[18] LIU Q. Role of cytokines in the pathophysiology of acute-on-chronic liver failure[J]. Blood Purif, 2009, 28:331-341.

MetforminattenuatesacuteliverinjuryandinflammatoryresponseinducedbyD-galactosamineincombinationwithPam3CSK4inSDrats

WU Li-tao1,2, SUN Juan3, WANG Yu-han3, GUO Jin-lu3, LIU Yan3,DU Xiao-juan1,2, YAN Xiao-fei1,2, ZHANG Fu-jun1,2, LI Dong-min1,2
(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences of Xi’an Jiaotong University Health Science Center; 2. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases, Ministry of Education of China;3. Clinical Medicine (five-year program) of Grade 2013, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo investigate the anti-injury and anti-inflammation protective effects of metformin in acute-liver-injury SD rat model induced by D-galactosamine and Pam3CSK4.MethodsEighteen male Sprague-Dawley rats were treated with the mixture of D-galactosamine (350 mg/kg) and Pam3CSK4 (50 μg/kg) by intraperitoneal injection (i.p.) to construct acute liver injury model. The rats in intervention group were given PBS and metformin, respectively. The liver and body weight were measured and the ratio of liver weight to body weight was calculated. HE staining was used to observe the pathological changes of the liver. Fasting serum was collected for detection of serological parameters. ELISA and RT-qPCR were used to determine the expression levels of IL-6 and TNF-α. Finally, activation of MAPK signal pathway in rat liver was detected by Western blot.ResultsCompared with those in control group, the ratio of body weight to liver weight, serum transaminase and proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were all significantly increased in the two intervention groups. Meanwhile, hepatic degeneration and hepatic interstitial exudation indicated that D-galactosamine combined with Pam3CSK4 successfully constructed acute liver injury model in the SD rats. Compared with PBS group, the ratio of body weight to liver weight, hepatic damage, serum transaminase levels, and the expressions of proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were significantly decreased in metformin-treated group. Meanwhile, the expressions of p-ERK1/2, p-SAPK/JNK and p-P38 MAPK decreased in liver tissues by metformin pretreatment, suggesting that metformin may play an anti-inflammatory effect by suppressing MAPK signaling pathway.ConclusionMetformin attenuated inflammatory reactions in SD rats with acute liver injury induced by D-galactosamine and Pam3CSK4.

D-galactosamine; Pam3CSK4; metformin; acute liver injury; inflammation

2017-03-15

2017-10-14

國家自然科學基金資助項目(No.81370952)；陜西省科技計劃項目(No.2013K21-22-03)；2015年西安交通大學省級大學生創(chuàng)新訓練項目(No.89)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81370952), the Natural Science Basic Research Program of Shaanxi Province (No.2013K21-22-03) and the Provincial Innovative Training Program for College Students in Xi’an Jiaotong University (No.89)

李冬民，教授. E-mail: lidongm@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171204.1751.016.html(2017-12-04)

R34

A

10.7652/jdyxb201801010

(編輯 韓維棟)