潘軍強(qiáng)，張殿新，孫超峰，楊 進(jìn)(. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防基因組醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 70069；. 第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 700；. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 7006)

◇基礎(chǔ)研究◇

鹽酸吡咯列酮對(duì)血紅素氧合酶-1在動(dòng)脈粥樣硬化模型兔主動(dòng)脈表達(dá)的影響

潘軍強(qiáng)1，張殿新2，孫超峰3，楊 進(jìn)1
(1. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防基因組醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710069；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710032；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

目的探討鹽酸吡格列酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型兔主動(dòng)脈血紅素氧合酶-1表達(dá)的影響。方法36只遺傳性高脂血癥兔，隨機(jī)分為對(duì)照組、高脂模型組、鹽酸吡格列酮組3組(n=12) 。對(duì)照組及高脂模型組分別以普通飼料與高脂飼料喂養(yǎng)，鹽酸吡格列酮組予以高脂飼料并吡格列酮[8 mg/(kg·d)]灌胃，持續(xù)飼養(yǎng)12周。免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及 Western blot法測(cè)定 3組兔主動(dòng)脈中血紅素氧合酶-1的表達(dá)。結(jié)果3組兔主動(dòng)脈血管平滑肌與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中明顯可見血紅素氧合酶-1的表達(dá)。鹽酸吡格列酮組兔的主動(dòng)脈壁中血紅素氧合酶-1表達(dá)低于高脂模型組，較對(duì)照組顯著增高(P<0.05)。結(jié)論鹽酸吡格列酮可上調(diào)血紅素氧合酶-1在主動(dòng)脈的表達(dá)，進(jìn)而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

血紅素氧合酶-1；鹽酸吡格列酮；動(dòng)脈粥樣硬化；主動(dòng)脈；兔

在臨床上，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是最常見的心血管疾病，其特征性病理變化為動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、變硬，動(dòng)脈壁彈性減低及粥樣斑塊形成[1]。AS的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，研究表明：諸多危險(xiǎn)因素如吸煙、脂質(zhì)代謝紊亂、高血壓及糖尿病等通過促發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活血管壁慢性炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[2]。血紅素氧合酶-1(hemooxygenase-1, HO-1)是熱休克蛋白家族成員之一，又稱熱休克蛋白32(heat shock protein 32, HSP32)，廣泛存在于肝、脾及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和骨髓等組織，同時(shí)也是血管內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞中一種重要的氧化酶。氧化應(yīng)激、重金屬、感染、缺血再灌注及其底物血紅素均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)[3-4]。HO-1高表達(dá)可通過抗氧化應(yīng)急、抑制炎癥反應(yīng)、抑制黏附分子及免疫調(diào)節(jié)等途徑延緩AS的發(fā)展。吡格列酮是一類臨床常用的噻唑烷二酮類降糖藥。研究提示，吡格列酮可通過調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞因子、氧化酶等的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮抗AS作用[5-8]。本研究以遺傳性高脂血癥(watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL)兔為研究對(duì)象，建立AS模型，觀察鹽酸吡格列酮對(duì)兔AS斑塊內(nèi)HO-1表達(dá)的影響，探討其抗AS的可能機(jī)制，為此類藥物用于人類AS防治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品1月齡健康雄性WHHL兔36只，體質(zhì)量(1.4±0.4)kg，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(A組)、高膽固醇飲食組(B組)及吡咯列酮加高膽固醇飲食組(C組)，每組各12只。A組：120 g/d正常飼料飼喂；B組：120 g/d高膽固醇飼料飼喂；C組：高膽固醇飼料(120 g/d)+吡格列酮[8 mg/(kg·d)]灌胃。飼喂8周后處死每組WHHL兔。鹽酸吡格列酮片、高膽固醇飼料均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一提供。

1.2試劑、儀器及標(biāo)本留取實(shí)驗(yàn)中所需各種試劑盒、緩沖液、抗體稀釋液及HO-1鼠抗兔多克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡、病理圖文分析系統(tǒng)、PCR儀及Gel Doc100 成像系統(tǒng)均由教育部西安交通大學(xué)心血管離子通道疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。飼喂8周后耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉全身麻醉后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，立即分離主動(dòng)脈，清除雜質(zhì)，生理鹽水反復(fù)沖洗，中性甲醛溶液固定。

1.3組織學(xué)檢查與圖像分析Masson染色觀察主動(dòng)脈血管斑塊內(nèi)膠原纖維成分，經(jīng)Masson染色后膠原纖維、黏液呈藍(lán)色，纖維素、細(xì)胞質(zhì)呈紅色。免疫組織化學(xué)染色觀察主動(dòng)脈血管內(nèi)皮HO-1表達(dá)水平。結(jié)果判定：HO-1陽性表達(dá)為細(xì)胞胞質(zhì)中有棕黃色顆粒隨機(jī)選取4個(gè)視野，200倍鏡下觀察，圖象分析采用病理組織實(shí)時(shí)攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像，并使用圖像分析軟件分析陽性面積百分比。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Westernblot技術(shù)測(cè)定主動(dòng)脈血管組織中HO-1的mRNA與蛋白表達(dá)量提取各組動(dòng)物的主動(dòng)脈血管組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列：HO-1上游引物5′-CAGTGCACACAGTTCAAC-3′，下游引物5′-TAAGGCAACCTCGGAAGC-3′；GAPDH上游引物5′-CCTCCTGCACCACCAACT-3′，下游引物5′-CTT-CTGGGT GGCAGTGATG-3′。提取主動(dòng)脈血管組織總蛋白，BCA試劑盒測(cè)蛋白總濃度，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品實(shí)際濃度(μg/μL)。然后按照標(biāo)準(zhǔn)Western blot技術(shù)操作流程行主動(dòng)脈血管組織中HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)。Gel Doc100 成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理，記錄結(jié)果。采用目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶吸光面積積分的比值分析目的蛋白。

2 結(jié) 果

2.13組間主動(dòng)脈AS程度的比較C組AS斑塊面積與動(dòng)脈內(nèi)膜面積比值、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比均低于B組而高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表13組斑塊面積百分比及內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比的比較

A組：正常對(duì)照組；B組：高膽固醇飲食組；C組：吡咯列酮加高膽固醇飲食組。與A組比較，★★P<0.01；與B組比較，☆P<0.05。

2.23組間動(dòng)脈壁及AS斑塊Masson染色的比較經(jīng)Masson 染色后發(fā)現(xiàn)，A組動(dòng)物主動(dòng)脈組織中可見少量膠原纖維；B組動(dòng)物主動(dòng)脈組織中藍(lán)色膠原纖維組織顯著增生，內(nèi)膜下、間質(zhì)中膠原沉積表達(dá)量顯著增多，膠原纖維呈條索狀穿梭于紅色的平滑肌細(xì)胞之間或迂曲包繞平滑肌細(xì)胞，平滑肌肌束被大量條索狀膠原纖維所分隔；C組動(dòng)物主動(dòng)脈組織藍(lán)色膠原纖維組織增生程度介于A、B組之間(圖1)。

圖13組間動(dòng)脈壁及AS斑塊的Masson染色情況

Fig.1 Masson staining of arterial wall and aortic AS plaque area (Masson staining, ×200)

A：正常對(duì)照組；B：高脂飲食組；C：高膽固醇飲食加吡咯列酮組。

2.33組間HO-1特異性染色表達(dá)陽性面積比的比較C組、B組和A組血管壁HO-1表達(dá)分別為：(27.45±2.92)%、(33.49±8.26)%、(16.71±3.72)%。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，C組HO-1表達(dá)高于A組而低于B組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖23組間動(dòng)脈壁及AS斑塊HO-1的表達(dá)情況

Fig.2 Expression of HO-1 in aortic AS plaque area (Immunohistochemical staining, ×200)

A：正常對(duì)照組；B：高脂飲食組；C：高膽固醇飲食加吡咯列酮組。

2.43組間動(dòng)脈壁及AS斑塊組織HO-1蛋白和mRNA表達(dá)的比較應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)3組間動(dòng)脈壁及AS斑塊組織HO-1蛋白水平。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，心房組織中HO-1的蛋白相對(duì)表達(dá)在A、B、C組分別為：0.652±0.093、1.957±0.237、1.082±0.163。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定3組間HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)(2-△△Ct值)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心房組織中HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)在A、B、C組分別為：0.861±0.086、1.936±0.347、1.142±0.183。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)，C組HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)均高于A組而低于B組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

3 討 論

HO-1是一種應(yīng)激性反應(yīng)蛋白，其通過抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞增殖、抗凋亡、抑制血小板聚集及炎癥損傷、調(diào)節(jié)血管壁的緊張性和參加細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞等機(jī)制對(duì)心血管系統(tǒng)起著保護(hù)作用[9]。已有研究證實(shí)，冠心病患者的內(nèi)皮細(xì)胞、AS斑塊內(nèi)以及平滑肌細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)增加[10]；HO-1及HO-1的mRNA在AS發(fā)展的過程中表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)[11]。大量實(shí)驗(yàn)表明，PPAR-γ及其配體在體內(nèi)多種細(xì)胞中均有表達(dá)，諸如巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等，具有直接的血管效應(yīng)，激活后可直接在血管壁水平拮抗上述病理作用[12-13]。吡格列酮是人工合成的特異性PPAR-γ激動(dòng)劑，同時(shí)也作為一種口服治療2型 糖尿病的降糖藥在臨床上廣泛應(yīng)用[14]。新近研究表明，吡格列酮抗AS的直接效應(yīng)包括增加一氧化氮的生物利用度，減少白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減少血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖及巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流[15]。此外，吡格列酮抗AS的間接效應(yīng)為：吡格列酮激活PPAR-γ后，通過脂肪組織調(diào)控炎性因子的基因表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[16]。

圖33組間HO-1蛋白與mRNA的表達(dá)情況

Fig.3 Expressions of HO-1 mRNA and protein in each group

A：3組間HO-1蛋白表達(dá)；B：3組間HO-1蛋白表達(dá)的比較；C：3組間HO-1的mRNA表達(dá)的比較。A組：正常對(duì)照組；B組：高脂飲食組；C組：高膽固醇飲食加吡咯列酮組。

正常情況下HO-1在人體內(nèi)基礎(chǔ)表達(dá)量很低，但眾多因素均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)：如血紅素、內(nèi)毒素、一氧化氮、細(xì)胞因子、重金屬等。HO-1作為熱休克蛋白家族成員之一，主要作用是以限速酶的形式催化游離血紅素降解為膽綠素、游離鐵、一氧化碳等，膽綠素可迅速還原成膽紅素，膽紅素是細(xì)胞內(nèi)目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一。一氧化碳作為細(xì)胞內(nèi)氣體信號(hào)分子之一，具有抑制炎癥反應(yīng)、改善血管生物學(xué)活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等作用。HO-1/膽紅素/一氧化碳共同組成的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織等對(duì)抗炎癥及氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要作用，合理上調(diào)HO-1的表達(dá)將成為AS防治的重要靶點(diǎn)。吡格列酮進(jìn)入心肌、骨骼肌及脂肪等組織細(xì)胞后，可能通過激活PPAR-γ，抑制脂肪細(xì)胞分泌炎癥因子、血管粘附因子、纖溶激活酶抑制劑-1等細(xì)胞因子，促進(jìn)脂聯(lián)素、一氧化氮等分泌，而后者可誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)。

本研究以AS易感動(dòng)物WHHL兔為研究對(duì)象，建立兔AS模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western blot法觀察鹽酸吡格列酮對(duì)兔AS斑塊內(nèi)HO-1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常新西蘭兔進(jìn)食高膽固醇飼料后，主動(dòng)脈血管壁HO-1表達(dá)陽性面積比明顯升高，高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動(dòng)脈血管壁HO-1表達(dá)陽性面積少于高膽固醇飲食組，進(jìn)一步證實(shí)了吡咯列酮可能通過上調(diào)HO-1的表達(dá)從而發(fā)揮其抗AS的作用，為此類藥物用于人類AS防治提供了理論依據(jù)。隨著對(duì)AS發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，有關(guān)吡格列酮對(duì)HO-1的影響及在抗AS中的作用將成為新的研究熱點(diǎn)。

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Effectsofpiogiltazoneontheexpressionofhemooxygenase-1inaorticatherosclerosisplaqueareainrabbits

PAN Jun-qiang1, ZHANG Dian-xin2, SUN Chao-feng3, YANG Jin1
(1. Institute of Genome-based Preventive Medicine, Life Sciences School of Northwest University, Xi’an 710069; 2. Department of Cardiovascular Diseases,Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032;3. Department of Cardiovascular Diseases, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo investigate the effects of piogiltazone on the expression of hemooxygenase-1 in aortic atherosclerosis plaque area in rabbits.MethodsWe randomly divided 36 Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits into 3 groups: control group, high-cholesterol diet group, and high-cholesterol diet with pioglitazone [8 mg/(kg·d)] group, with 12 in each. All the animals were fed for 12 weeks and then sacrificed. Rabbit aortic atherosclerosis pathological features were observed by Masson staining; the expression of hemooxygenase-1 in aortic atherosclerosis plaque area in rabbits was detected by immunohistochemistry, real-time quantitative PCR and Western blot techniques.ResultsHemooxygenase-1 expression was obvious in the smooth muscle in aortic vessels and atherosclerosis plaques in the three groups of rabbits. The expression of hemooxygenase-1 was lower in high-cholesterol diet with pioglitazone group than in high-cholesterol diet group and significantly higher than in control group (P<0.05).ConclusionPioglitazone can slow down the progression of atherosclerosis by up-regulating the expression of hemooxygenase-1.

hemooxygenase-1; pioglitazone; atherosclerosis; aorta; rabbit

2017-03-30

2017-06-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270236)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81270236)

楊進(jìn)，教授，博士生導(dǎo)師. E-mail: yangjin@nwu.edu.cn

優(yōu)先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171204.1720.010.html(2017-12-04)

R743.1

A

10.7652/jdyxb201801006

(編輯 韓維棟)