梁萌萌，張子平，賈錫偉，王藝磊*

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

擬穴青蟹miR-34靶基因預測及其生物信息學分析

梁萌萌1，張子平2，賈錫偉1，王藝磊1*

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

MiR-34是一類在進化過程中高度保守的miRNA家族，參與機體的許多重要生命活動。本研究首先比較本實驗室構建的擬穴青蟹miRNA數(shù)據(jù)庫中的miR-34(spa-miR-34)和通過miRBase獲得的多個物種的miR-34的序列特征，然后應用RNAhybrid和Segal Lab兩種在線工具預測spa-miR-34的靶基因，用blast2go軟件對這些靶基因進行功能注釋和信號通路富集分析。結果表明，spa-miR-34可能的靶基因有66個，這些基因的功能主要包括氧化還原、磷酸化、鈣離子跨膜運輸、轉錄等生物學過程；信號通路主要富集于精氨酸和脯氨酸代謝、抗生素生物合成、苯丙素生物合成、糖酵解和糖異生等合成代謝通路中。spa-miR-34預測的靶基因所涉及的基因家族和通路亦包括CHH家族、ERK通路、細胞周期和UPP通路、SUMO通路。此外，spa-miR-34預測的靶基因還有蛻皮激素受體，推測spa-miR-34在生殖、蛻皮及氨基酸等物質(zhì)代謝方面具有重要作用。本研究為進一步了解spa-miR-34在擬穴青蟹中的作用提供了重要參考資料。

miR-34；靶基因；生物信息學；擬穴青蟹

MicroRNA(簡稱miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度約22～25個核苷酸，在動物中其通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)的不完全性互補配對，引起轉錄抑制或者下調(diào)，進而參與調(diào)控機體內(nèi)多種重要的生命活動過程，如生長發(fā)育、生殖和免疫等[1-2]。

MiR-34是一類在進化過程中高度保守的miRNA家族，且廣泛存在于后生動物中[3]。越來越多的研究表明miRNA-34在機體生命活動中發(fā)揮著重要的作用[4]，如參與人類癌癥的發(fā)生[5-6]及衰老過程[7-8]，但在擬穴青蟹中，目前對其miRNA-34的研究未見報道。根據(jù)擬穴青蟹miR-34(spa-miRNA-34)靶基因的預測結果，通過數(shù)據(jù)整合和應用生物信息學分析方法，進一步挖掘理論上存在的可能結果，并對結果進行系統(tǒng)分析整理，可為spa-miR-34靶基因的實驗鑒定及其生物學功能研究提供數(shù)據(jù)支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

spa-miR-34：擬穴青蟹購自廈門集美農(nóng)貿(mào)市場，分別提取不同性腺發(fā)育階段的三個眼柄的RNA，等量混合RNA分別形成雌雄眼柄RNA兩個樣品池，送至杭州聯(lián)川生物技術有限公司，采用illumina二代測序儀進行高通量測序并通過生物信息學分析獲得擬穴青蟹眼柄miRNA數(shù)據(jù)庫，從該數(shù)據(jù)庫中獲得了表達量較高的spa-miR-34。

不同物種的miR-34：搜索miRBase(http：//www.mirbase.org/)可獲得不同動物的miR-34的成熟序列。

擬穴青蟹基因的3′UTR：通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取擬穴青蟹所有已知基因的3′UTR，用于進行靶基因的預測。

1.2 方法

通過MEGA7軟件對本實驗室高通量測序獲得的spa-miRNA-34和miRBase獲得的miR-34進行比對，分析不同物種miR-34的保守性。

利用RNAhybrid(http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid?id=rnahybrid_view_submission)和Segal Lab(https：//genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/prediction.html)兩種通用的靶基因預測軟件對spa-miRNA-34進行靶基因預測，取預測結果的交集。根據(jù)miRNA預測靶基因的原理，RNAhybrid在線預測軟件設置的參數(shù)為：種子區(qū)域第二位至第八位互補，允許G∶U配對，最小結合自由能(MFE)設置為-20 kcal/mol，結合自由能越低表示miR-34與靶基因的3′UTR區(qū)結合越緊密；Segal Lab在線預測軟件設置的參數(shù)為：種子區(qū)域第二位至第八位互補，允許G∶U配對，允許單個錯配。由于擬穴青蟹屬非模式生物，數(shù)據(jù)庫中的基因信息不足，使用RNAhybrid和Segal Lab在線軟件更加方便進行靶基因預測。

利用blast2go(https：//www.blast2go.com/)中的 GO注釋和KEGG通路分析對spa-miR-34的所有靶基因進行功能注釋和信號通路的富集分析。利用blast2go軟件進行blast時設置的參數(shù)為：E值為1.0E-3。進行功能注釋時的參數(shù)設置為E值為1.0E-6，其他采用默認值。

2 結果與分析

2.1 miR-34的保守性

通過搜索miRBase發(fā)現(xiàn)miR-34是研究比較廣泛且深入的一種miRNA，分別檢索人、鼠、果蠅等16個物種及實驗室獲得的spa-miR-34成熟序列，利用MEGA7對miRBase數(shù)據(jù)庫獲得的不同物種的miR-34進行ClustalW分析，比對結果發(fā)現(xiàn)17個物種的miR-34序列一致性極高(表1)，表明miR-34在不同物種間具有高度的保守性。

表1 不同物種的miR-34的成熟序列

續(xù)表1

注：紅色表示完全相同的堿基，下劃線表示種子序列。

Note：The same nucleotidesare in red，seed sequences are underlined.

2.2 spa-miR-34靶基因的預測

用RNAhybrid和Segal Lab2在線工具預測spa-miR-34的靶基因，選取預測結果的交集，得到66個spa-miR-34的靶基因(表2)。

表2 2種在線工具預測miR-34靶基因的交集

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 spa-miR-34靶基因的GO分析

為進一步認識spa-miR-34的靶基因，對集合中的66個基因進行GO分類富集分析，GO注釋得到56個基因的GO生物學過程注釋信息，將這56個基因投到GO的生物學過程上，結果發(fā)現(xiàn)spa-miR-34的靶基因主要富集于氧化還原過程、磷酸化過程、鈣離子跨膜運輸、轉錄等生物學過程(表3)。

表3 spa-miR-34預測靶基因GO生物學過程分析

續(xù)表3

2.4 miR-34靶基因的KEGG分析

在GO注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)，對基因集合中的66個基因進行生物通路富集分析。結果顯示：在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中Spa-miR-34預測靶基因集合顯著富集于精氨酸和脯氨酸代謝通路、生物合成抗生素通路、苯丙素生物合成通路、糖酵解和糖異生等通路(表4)。

表4 spa-miR-34預測靶基因的通路分析

3 討論

靶基因mRNA的3’端UTR區(qū)和miRNA5’端第2～8位堿基完全互補，這7個堿基序列稱作“miRNA種子區(qū)”[3]。MiR-34作為進化上較為保守的轉錄后調(diào)控因子，一定程度地表現(xiàn)在與靶基因進行識別的“種子序列”中[9]?！胺N子序列”的保守性較高可能反映出miR-34在物種演化過程中始終扮演著重要的角色。本實驗室前期在性腺miRNA組的測序中獲得了spa-miR-34，關于miR-34靶基因的研究及驗證，多集中在高等動物中，在水產(chǎn)無脊椎動物中尚未涉及。在人類中miR-34的靶基因有E2F2[10]NumbL[11]、Notch1[11]、OCT4[12]、DLL1[13]、IGFBP-3等[14]。在蜜蜂中的靶基因有eve、ftz-f1和act5C[15]。

通過生物信息學方法預測spa-miR-34靶基因，對spa-miR-34靶基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因的功能主要富集于氧化還原、磷酸化、鈣離子跨膜運輸、轉錄等生物學過程中。其中富集最多的是抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶基因，如cMnSOD、CuZnSOD、CAT等，說明spa-miR-34可能參與擬穴青蟹的抗氧化防御過程。對spa-miR-34靶基因進行生物通路的分析，發(fā)現(xiàn)信號通路主要富集于精氨酸和脯氨酸代謝、抗生素生物合成、苯丙素生物合成、糖酵解和糖異生等合成代謝通路中，說明spa-miR-34可能參與氨基酸等物質(zhì)代謝過程。

spa-miR-34預測的靶基因所涉及的基因家族和通路亦包括CHH家族(CHH，MIH)[16]、ERK通路(MAPK，MAPKK，STAT，14-3-3)[17-19]、細胞周期和UPP通路(cyclinA，cyclinH，CDC2，UBE2I)[20-21]、SUMO通路(SUMO-2)[22-23]。CHH家族神經(jīng)肽是調(diào)節(jié)甲殼動物生長發(fā)育、生殖、蛻皮等生理過程的重要激素，例如CHH可以刺激卵黃發(fā)生，促進生殖[24]，MIH不僅調(diào)控蛻皮的發(fā)生，也能促進性腺的發(fā)育[24-25]。ERK通路在卵母細胞減數(shù)分裂、受精、胚胎發(fā)育、細胞凋亡、突觸可塑性和記憶形成等時期均起作用[26]。ERK通路在甲殼動物性腺發(fā)育中的作用已逐漸被認識[17，27]。細胞周期和UPP通路涉及機體的各種基本生理過程，在精子發(fā)生、成熟，受精，卵母細胞減數(shù)分裂，卵子發(fā)生，早期胚胎發(fā)育，性腺發(fā)育等階段均有作用[28]。例如，CDC2和cyclin B參與了擬穴青蟹性腺發(fā)育[21]，UBE2I在小鼠卵母細胞基因表達中起SUMO化的作用[29]。SUMO通路在卵母細胞減數(shù)分裂[30]、轉錄活性調(diào)控、核質(zhì)轉運、細胞周期調(diào)控、DNA的復制與修復以及信號的轉導[31]等方面發(fā)揮重要作用。戴燕彬[32]研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹SUMO通路在卵巢的早期發(fā)育、配子發(fā)生過程亦起重要作用。預測的靶基因涉及以上通路，說明spa-miR-34在生殖方面可能起重要作用。

此外，spa-miR-34預測的靶基因還有蛻皮激素受體(EcR)，它是蛻皮激素的作用靶標，因此，spa-miR-34可能也參與擬穴青蟹的蛻皮過程。

由于擬穴青蟹屬非模式生物，數(shù)據(jù)庫中的基因信息不足，無法進行更深入的挖掘，相信隨著擬穴青蟹基因在數(shù)據(jù)庫中的豐富，spa-miR-34的作用會獲得更深入的闡釋。通過對miR-34靶基因進行生物通路的分析，可以從調(diào)控網(wǎng)絡層面挖掘miR-34的調(diào)控機制，看到基因層面看不到的信息，從而在調(diào)控層面更全面地了解miR-34的生物學功能，對了解miR-34對擬穴青蟹的調(diào)控機制奠定基礎。但所預測的miR-34靶基因在擬穴青蟹中是否為miR-34的直接靶基因或間接靶基因需要進一步實驗驗證，目前本實驗室正在進行相關的工作。

[1]Hwang H W，Mendell J T.MicroRNAs in cell proliferation，cell death，and tumorigenesis[J].British Journal of Cancer，2006，94(6)：776-780.

[2]王天宇，董園園，李海燕，等.MicroRNAs的分子進化與調(diào)控機制[J].遺傳，2010，32(9)：277-279.

[3]高佳莉，羅玉萍，李思光.miR-34基因家族的分子進化[J].動物學研究，2007，28(3)：271-278.

[4]Engkvist M E，Stratford E W，Lorenz S，et al.Analysis of the miR-34 family functions in breast cancer reveals annotation error of miR-34b[J].Scientific Reports，2017，7(1)：9655.

[5]Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis[J].Cell Death and Differentiation，2010，17(2)：193-199.

[6]Slabáková E，Culig Z，Rem?ík J，et al.Alternative mechanisms of miR-34a regulation in cancer[J].Cell Death and Disease，2017，8(10)：e3100.

[7]Liu N，Landreh M，Cao K，et al.The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila[J].Nature，2012，482(7386)：519-523.

[8]Aw S，Cohen S M.Time is of the essence：microRNAs and age-associated neurodegeneration[J].Cell Research，2012，22(8)：1218-1220.

[9]Grimson A，F(xiàn)arh K K，Johnston W K，et al.MicroRNA targeting specificity in mammals：determinants beyond seed pairing[J].Molecular Cell，2007，27(1)：91-105.

[10]Pulikkan J A,Peramangalam P S,Dengler V,et al.C/EBPα regulated microRNA-34a targest E2F3 during granulopoiesis and is down-regulated in AML with CEBPA mutations[J].Blood,2010,116(25):5638-5649.

[11]Mollinari C，Racaniello M，Berry A，et al.MiR-34a regulates cell proliferation，morphology and function of newborn neurons resulting in improved behaviouraloutcomes[J].Cell Death and Disease，2015，6(1)：e1622.

[12]Ng W L，Chen G，Wang M，et al.OCT4 as a target of miR-34a stimulates p63 but inhibits p53 to promote human cell transformation[J].Cell Death and Disease，2014，5(1)：e1024.

[13]Pu Y，Zhao F，Wang H，et al.MiR-34a-5p promotes multi-chemoresistance of osteosarcoma through down-regulation of the DLL1 gene[J].Scientific Reports，2017，7：44218.

[14]Yin H，Zhang S，Sun Y，et al.MicroRNA-34/449 targets IGFBP-3 and attenuatesairway remodeling by suppressing Nur77-mediated autophagy[J].Cell Death and Disease，2017，8(8)：e2998.

[15]Freitas F C，Pires C V，Claudianos C，et al.MicroRNA-34 directly targets pair-rule genes and cytoskeleton component in the honey bee[J].Scientific Reports，2017，7：40884.

[16]王曉偉，張子平，王藝磊，等.蝦蟹類卵巢發(fā)育調(diào)節(jié)機制研究進展[J].生物技術通報，2013，(7)：29-35.

[17]Ma A N，Wang Y L，Zou Z H，et al.Erk2 in ovarian development of green mud crabScyllaparamamosain[J].DNA and Cell Biology，2012，31(7)：1233-1244.

[18]馬阿妮.ERK信號轉導通路相關基因在擬穴青蟹卵巢發(fā)育中的作用研究[D].廈門：集美大學，2011.

[19]王曉偉.調(diào)控擬穴青蟹卵巢發(fā)育的眼柄轉錄組學分析[D].廈門：集美大學，2013.

[20]Zou Z H，Zhang Z P，Wang Y L，et al.EST analysis on the gonad development related organs and microarray screen for differentially expressed genes in mature ovary and testis ofScyllaparamamosain[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part D：Genomics and Proteomics，2011，6(2)：150-157.

[21]Han K H，Wang Y L，Zhang Z P，et al.Molecular characterization and expression profiles of cdc2 and cyclin B during oogenesis and spermatogenesis in green mud crab(Scyllaparamamosain)[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry & Molecular Biology，2012，163(3-4)：292-302.

[22]Dai Y B，Wang Y L，Zhang Z P，et al.SUMO-1 of mud crab(Scyllaparamamosain)in gametogenesis[J].Gene，2012，503(2)：260-268.

[23]Gao J，Wang Y L，Zhang Z P，et al.Transcriptome analysis of the differences in gene expression between testis and ovary in green mud crab(Scyllaparamamosain)[J].BMC Genomics，2014，15(1)：585.

[24]Zmora N，Trant J，Zohar Y，et al.Molt-inhibiting hormone stimulates vitellogenesis at advanced ovarian developmental stages in the female blue crab，Callinectessapidus1：an ovarian stage dependent involvement[J].Saline Systems，2009，5(1)：7.

[25]Tiu S H K，Chan S M.The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonad-stimulating hormone from the shrimpMetapenaeusensis[J].The FEBS Journal，2007，274(17)：4385-4395.

[26]馬阿妮，王藝磊，張子平，等.MAPK 信號途徑及其在水生無脊椎動物的研究進展[J].生命科學，2010，22(10)：979-984.

[27]Devaraj H，Saravanakumar M，Thiyagu M.Induction of ovarian maturation inPenaeusmonodonby molecular signal interventional approach[J].Journal of Experimental Zoology Part B：Molecular and Developmental Evolution，2012，318(7)：572-585.

[28]韓坤煌，張子平，王藝磊，等.Cyclin-CDK-CKI 及UPP 參與生殖調(diào)控及在甲殼動物性腺發(fā)育中的研究進展[J].生物技術通報，2010，(7)：49-54.

[29]Ihara M，Stein P，Schultz R M.UBE2I( UBC9)，a SUMO-conjugating enzyme，localizes to nuclear speckles and stimulates transcription in mouse oocytes[J].Biology of Reproduction，2008，79(5)：906-913．

[30]袁一峰.SUMO-1在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的作用及其分子機制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2014.

[31]陳玲.Sumo信號通路對DAPK蛋白表達的調(diào)控[D].福州：福建師范大學，2016.

[32]戴燕彬.SUMO化信號通路相關基因在擬穴青蟹性腺發(fā)育過程中的作用研究[D].廈門：集美大學，2012.

PredictionandbioinformaticanalysisofmiR-34targetgenesinScyllaparamamosain

LIANG Mengmeng1，ZHANG Ziping2，JIA Xiwei1，WANG Yilei1*

(1.College of Fisheries，Jimei University，Xiamen 361021，China；2.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China)

MiR-34 is a family of microRNAs that is highly conserved in evolution and is involved in many important life activities.In this study，the sequences characteristics between spa-miR-34 ofScyllaparamamosainfrom the database constructed by our laboratory and miR-34 of other animals from the miRBase were compared，and then the spa-miR-34 target genes were predicted by two online tools：RNAhybrid and Segal Lab.The functional annotation and signal pathway enrichment of these target genes were analyzed by using blast2go software.The results showed that the number of the predicted pa-miR-34 target gene was 66，and the functions of these genes are mainly distributed in the biological processes of oxidation-reduction，phosphorylation，calcium ion transmembrane transport，transcription，etc.Signal pathways related to these genes are mainly concentrated in the metabolism of arginine and proline metabolism，antibiotic biosynthesis，phenylpropanoid biosynthesis，glycolysis and glycogendysis，and other synthetic metabolic pathways.The predicted gene family and pathways of the spa-miR-34 target genes also include CHH family，ERK pathway，cell cycle and UPP pathway，and SUMO pathway.In addition，ecdysteroid receptor gene was also one of the predicted target genes.It is speculated that spa-miR-34 plays an important role in the reproduction，molt and the metabolism of amino acids and other substances.This study provides an important reference for further understand the role of spa-miR-34 inS.paramamosain.

miR-34；target genes；bioinformatics；Scyllaparamamosain

2017-11-15

國家自然科學基金(41676161，31672681，31472266).

梁萌萌(1988-)，女，研究生，從事水產(chǎn)動物生殖生物學研究.E-mail：1638785935@qq.com

王藝磊(1963-)，女，教授，從事水產(chǎn)動物生殖生物學研究.E-mail：ylwang@jmu.edu.cn

梁萌萌，張子平，賈錫偉，等.擬穴青蟹miR-34靶基因預測及其生物信息學分析[J].漁業(yè)研究，2017，39(6)：419-428.

Q811.4

A

1006-5601(2017)06-0419-10