朱志賢+于翠+李勇+莫榮利+鄧文+胡興明

摘要：從分子水平上解析桑樹(shù)在各種脅迫條件下的適應(yīng)機(jī)制，對(duì)桑樹(shù)抗逆育種、種質(zhì)資源保存及提高桑葉產(chǎn)量具有重要作用。主要介紹了桑樹(shù)抗高溫、低溫、干旱、高鹽和抗病分子機(jī)制研究的現(xiàn)狀，探討了桑樹(shù)抗逆分子育種的前景。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù)；抗高溫；抗低溫；抗干旱；抗高鹽；抗病性

中圖分類號(hào)：S888.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）23-4433-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.001

Research Progress on the Resistant Molecular Mechanism of Mulberry Tree

ZHU Zhi-xian，YU Cui，LI Yong，MO Rong-li，DENG Wen，HU Xing-ming

（Institute of Economic Crops，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： The adaptation mechanism of mulberry trees under various stress conditions was analyzed at the molecular level， which had an important effect on the resistance cultivation of mulberry trees， the preservation of germplasm resources and the increase of mulberry leaf production. The present situation of the mechanism of resistance to high temperature， low temperature， drought， high salt and disease resistance of mulberry trees was introduced， and the prospect of resistance to molecular breeding was discussed.

Key words： mulberry； heat resistance； drought resistance； salt resistance； disease resistance

桑樹(shù)是多年生經(jīng)濟(jì)植物，屬于薔薇目（Urticales）桑科（Moraceae）桑屬（Morus L.）桑種（Morus alba Linn），在亞洲、歐洲、美洲和非洲廣泛種植，在中國(guó)栽培范圍廣泛，為了適應(yīng)各地不同的環(huán)境條件，逐漸形成了大量品種。桑樹(shù)共有30個(gè)種10個(gè)變種，中國(guó)有15個(gè)種4個(gè)變種，是世界上桑樹(shù)種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家[1]。桑樹(shù)全身都是寶：桑葉可養(yǎng)蠶，還可用來(lái)制作桑茶、桑葉復(fù)合飲料、桑飼料、保健食品等；桑根（桑白皮）用作降壓藥原材料，且對(duì)中風(fēng)、神經(jīng)性疾病治療功效顯著；桑枝可作為培養(yǎng)基培育香菇、銀耳等食用菌，還可用于生產(chǎn)纖維板、人造棉，造紙、提取果膠；桑果是目前國(guó)際上熱門研究的第三代水果，保健功能較好，已被衛(wèi)生部正式列入首批“既是食品又是藥品”名單[2]。除了上述功能，桑樹(shù)對(duì)環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性，對(duì)惡劣的自然環(huán)境如高溫、干旱、寒冷與鹽堿等有較強(qiáng)的抗性，并且還能凈化空氣，對(duì)一些污染性氣體如氯氣、二氧化硫以及氯化氧也有抵抗性，在生態(tài)環(huán)境建設(shè)方面有良好的作用[3]。當(dāng)遭受各種生物和非生物逆境脅迫后，桑樹(shù)啟動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和分子水平上發(fā)生一系列變化。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展和形成了一套復(fù)雜的機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境的變化。目前高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被大量運(yùn)用到許多植物中，在桑樹(shù)上的運(yùn)用也逐漸增多，川桑全基因組序列公布（http：//morus.swu.edu.cn/morusdb/），為全基因組范圍內(nèi)鑒定桑樹(shù)抗性相關(guān)基因提供了重要數(shù)據(jù)[4]。另外，新一代測(cè)序技術(shù)加速了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組信息可準(zhǔn)確分析基因差異表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)變異、RNA編輯、基因功能注釋、SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記等，成為揭示各項(xiàng)生命活動(dòng)規(guī)律，發(fā)掘抗病基因及潛在信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)等研究的最佳手段，可豐富桑樹(shù)抗逆分子信息。桑樹(shù)抗逆性的研究已經(jīng)從種質(zhì)資源篩選、生理生化發(fā)展到分子水平。目前關(guān)于桑樹(shù)抗高溫、低溫、干旱、高鹽和抗病方面的分子機(jī)制研究較多。本研究主要介紹桑樹(shù)抗逆分子機(jī)制研究的現(xiàn)狀，探討抗逆分子機(jī)制研究在桑樹(shù)分子育種中的作用。

1 植物抗逆調(diào)控分子機(jī)理

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中常遇到細(xì)菌、真菌、病毒、卵菌和昆蟲導(dǎo)致的生物脅迫，威脅它們的生存和繁殖，同時(shí)它們還要面臨高溫、低溫、干早和高鹽等非生物脅迫，這些逆境條件導(dǎo)致植物延遲生長(zhǎng)、加劇衰老、減產(chǎn)甚至死亡。為了適應(yīng)多變環(huán)境，植物形成了復(fù)雜的抗逆機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。植物通過(guò)不同感受器接收到外界的逆境信號(hào)后，將這種信號(hào)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)并進(jìn)行傳遞，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，最終改變植物的生理和代謝而表現(xiàn)出相應(yīng)的抗性[6]。

1.1 植物非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制

Hirayama等[7]對(duì)不同植物的抗逆生理學(xué)及分子生物學(xué)分析繪制了非生物應(yīng)激反應(yīng)模型（圖1）。植物通過(guò)細(xì)胞表面的受體感知到外界信號(hào)后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生第二信使，包括Ca2+、活性氧（ROS）、磷酸肌醇（InsP）等，第二信使隨后與細(xì)胞內(nèi)多種不同的信號(hào)蛋白組成信號(hào)傳遞鏈，并通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)放大，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因包括一些調(diào)節(jié)蛋白及功能蛋白，通過(guò)一系列蛋白的共同作用[8]。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物組學(xué)等的發(fā)展，有助于獲得所有基因的信息。例如，基因序列及功能、轉(zhuǎn)錄水平、調(diào)控因子及剪接模式等。另外，使用小分子RNA、染色質(zhì)調(diào)節(jié)和基因組修飾等的新調(diào)控機(jī)制的研究使人們能夠認(rèn)識(shí)到植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)復(fù)雜的非生物壓力[7]。endprint

植物對(duì)非生物脅迫的分子反應(yīng)涉及多條分子信號(hào)途徑，其中最早調(diào)控信號(hào)途徑涉及活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS），其功能為修飾酶活性和進(jìn)行基因調(diào)控。Cramer等[9]提出了植物響應(yīng)非生物脅迫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的簡(jiǎn)化模型（圖2）。ROS和RNS形成了相互協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控很多植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)，目前關(guān)于ROS的調(diào)控有大量的報(bào)道，但是關(guān)于RNS的研究較少。其中最主要的涉及2個(gè)途徑：脫落酸（Abscisic acid，ABA）途徑和乙烯（Ethylene，ET）途徑。ABA是許多植物對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，尤其是滲透脅迫，它的信號(hào)傳導(dǎo)非?？焖偾也簧婕稗D(zhuǎn)錄活性。在響應(yīng)脅迫的信號(hào)傳遞過(guò)程中，根據(jù)是否需要ABA信號(hào)，可以分為依賴ABA的途徑和不依賴ABA的途徑。目前ABA信號(hào)途徑被鑒定主要包括3個(gè)核心元件：受體（PYR/PYL/RCAR）、蛋白磷酸酶9（PP2C）和蛋白激酶（SnRK2/OST1）。乙烯信號(hào)則參與多種應(yīng)激反應(yīng)，包括干旱、臭氧、缺氧、熱、冷、機(jī)械損傷和UV-B光[9，10]。

1.2 植物生物脅迫響應(yīng)機(jī)制

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到各種病原物的侵染，在長(zhǎng)期的生存進(jìn)化中，植物形成了各種各樣的機(jī)制防御病原菌入侵。植物不同水平的多個(gè)抗病途徑交叉、重疊組成植物的抗病防御機(jī)制使植物表現(xiàn)出多種抗病形式。其中誘導(dǎo)抗性和基礎(chǔ)抗性是最為典型的兩種抗病形式。一般認(rèn)為基礎(chǔ)抗性是指植物表現(xiàn)出的對(duì)病原菌的天然本底抗性，這種抗性是植物與生俱來(lái)的，即植物抵御病原物的侵染機(jī)制是利用植物本身與眾不同的結(jié)構(gòu)以及一些特殊化學(xué)成分，如覆蓋表皮細(xì)胞的角質(zhì)層、蠟質(zhì)、栓質(zhì)、木質(zhì)素及其他的一些特殊的結(jié)構(gòu)等，如果植物喪失了基礎(chǔ)抗性就會(huì)對(duì)病原菌表現(xiàn)出超感病性。

植物的誘導(dǎo)抗性機(jī)制是由于環(huán)境因子（包括生物因子和非生物因子）激活了植物的防御體系而產(chǎn)生對(duì)病原物的系統(tǒng)抗病性[11]。Jones等[12]對(duì)植物與病原菌之間的互作做了精煉的解析（圖3），植物防御反應(yīng)的第一階段，PAMPs（Pathogen-associated molecular patterns，病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫）被 PRRs（Pattern recognition receptors，細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體）識(shí)別，導(dǎo)致植物產(chǎn)生PTI（PAMP-triggered immunity，病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫），阻止病原菌的進(jìn)一步定殖。第二階段，成功入侵的病原菌會(huì)釋放毒力效應(yīng)子，干擾植物的PTI，使病原菌能生長(zhǎng)擴(kuò)散，導(dǎo)致ETS（Effector-triggered susceptibility，效應(yīng)因子激活的感病性）。第三階段，植物進(jìn)化出專一的R基因直接或間接識(shí)別病原物特異擁有的效應(yīng)因子，激發(fā)植物產(chǎn)生ETI（Effector-triggered immunity），ETI加速或放大PTI，使植物產(chǎn)生抗病性。第四階段，病原菌通過(guò)水平基因流獲得新的效應(yīng)子，可以幫助病原菌抑制植物的 ETI，同時(shí)植物新的R基因會(huì)識(shí)別病原菌獲得的新效應(yīng)子，再次引發(fā)ETI。

2 桑樹(shù)抗高溫機(jī)理研究

2.1 高溫脅迫對(duì)植物生理生化指標(biāo)的影響

高溫脅迫引起植物內(nèi)部發(fā)生一系列變化，包括生理、生化和基因水平等方面。

植物葉片和根系等器官對(duì)高溫非常敏感易受其影響，并且它們又是植物各種生理活動(dòng)中的主要功能器官，高溫會(huì)引起相關(guān)功能器官的變化，從而對(duì)植物的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用、水分和礦物質(zhì)元素吸收等生理活動(dòng)產(chǎn)生影響[13]。高溫脅迫打破了植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除這一動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)生過(guò)量單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫等一系列活性氧類（Reactive oxygen species，ROS），促使膜脂中不飽和脂肪酸過(guò)氧化形成丙二醛（Malondialdehyde，MDA），MDA的含量反映了膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)，因此，通常也作為植物耐熱性的指標(biāo)。

2.2 桑樹(shù)抗高溫分子機(jī)理

2.2.1 桑樹(shù)小分子量熱激蛋白 桑樹(shù)植物在高溫脅迫下能迅速合成一類蛋白——熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）。HSPs作為分子伴侶，能協(xié)助新生肽鏈折疊、組裝、定位、運(yùn)輸，修復(fù)脅迫下的變性蛋白及降解錯(cuò)誤折疊的蛋白。按照分子量的大小將HSPs分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量熱激蛋白（Small heat shock protein，sHSPs）五大類。sHSPs是一類最不保守的HSPs，擁有種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜與功能多樣性特點(diǎn)。在高溫脅迫下，sHSPs結(jié)合非天然蛋白防止其發(fā)生不可逆聚集，在植物抵抗高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。盧承瓊[14]通過(guò)生物信息學(xué)方法，從桑樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了29個(gè)sHSPs，氨基酸長(zhǎng)度介于136～240 aa之間，分子量大小為15.68～26.84 kD之間，等電點(diǎn)大小介于4.49～9.34之間。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，將川桑sHSPs分為13個(gè)亞家族和1個(gè)孤兒基因。組織表達(dá)譜分析顯示29個(gè)sHSPs在川桑根、皮、葉、冬芽和雄花5種組織中各有表達(dá)。以印度桑K2為材料提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA作為模板，克隆了13個(gè)sHSPs基因，利用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了高溫、低溫、干旱和高鹽4種非生物脅迫處理下sHSPs在印度桑K2葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，10個(gè)sHSPs基因都迅速地響應(yīng)高溫脅迫。其中小分子熱激蛋白基因Mi168-CI響應(yīng)高溫、低溫、干旱和高鹽4種非生物脅迫，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，將該基因通過(guò)過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物煙草，轉(zhuǎn)Mi168-CI煙草在高溫脅迫下的MDA含量低于野生型煙草，而抗氧化酶SOD、POD的活性高于野生型煙草，表明能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐熱性。

2.2.2 MAPK基因家族 蛋白的磷酸化和去磷酸化是生物內(nèi)普遍存在的一種響應(yīng)外界變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。目前研究的參與植物生物脅迫和非生物脅迫的蛋白激酶主要有5類：受體蛋白激酶（Receptor-like kinase，RLK）、促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）、鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴蛋白激酶（Calcium-dependent and Calmodulin-independent protein kinase，CDPK）、蔗糖不發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase， SnRK）及其他脅迫相關(guān)的植物蛋白激酶。MAPK基因作為MAPK級(jí)聯(lián)途徑中最下游的蛋白激酶，可通過(guò)逐級(jí)磷酸化作用，將細(xì)胞外的信息級(jí)聯(lián)放大，調(diào)控下游基因的表達(dá)，與其他基因一起形成龐大的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各種生理反應(yīng)，響應(yīng)外界環(huán)境[15]。魏從進(jìn)[16]利用生物信息學(xué)方法在川?；蚪M中鑒定得到個(gè)47個(gè)桑樹(shù)促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族基因；以生長(zhǎng)兩個(gè)月的湖桑幼苗為材料，對(duì)其進(jìn)行不同的脅迫（高溫，低溫，高鹽和干旱）和信號(hào)分子（ABA、SA、H2O2和MeJA）處理，QRT-PCR分析10個(gè)桑樹(shù)MAPK基因在不同脅迫處理下的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)MAPK基因可以受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，不同的桑樹(shù)基因?qū)Σ煌拿{迫處理有不同的脅迫應(yīng)答模式。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)MnMAPK6基因植株表現(xiàn)出對(duì)高溫敏感。張夢(mèng)[15]成功獲得5個(gè)Mn MAPK5過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，并對(duì)其進(jìn)行高鹽、干旱、低溫、高溫脅迫處理，MnMAPK5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠在不同的時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)脅迫。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)MnMAPK5在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核處都有分布。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MnMAPK5在川桑的根、莖、葉、皮、花、果各個(gè)組織都有表達(dá)，暗示MnMAPK5是一個(gè)組成型表達(dá)的基因。對(duì)MnMAPK5轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，其可能主要是通過(guò)降低抗氧化酶的活性和表達(dá)量及相應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增加ROS的積累，降低了高溫的抗性。endprint

2.2.3 DREB轉(zhuǎn)錄因子 植物與抗逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB類、bZIP類、WRKY類、NAC類、AP2/EREBP類等。AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是植物在抵御外界非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用的一類轉(zhuǎn)錄因子，并根據(jù)含有結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及功能分為了AP2，RAV，ERF，DREB 4類。劉雪琴[17]根據(jù)桑樹(shù)DREB基因的非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜，篩選出MnDRE4A進(jìn)行基因功能研究，將MnDRE4A基因的啟動(dòng)子與標(biāo)記基因GUS連接，并通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入擬南芥中，用高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）、高鹽（150 mmol/L NaCl）和干旱（20% PEG600）4種脅迫處理獲得的的轉(zhuǎn)基因擬南芥，結(jié)果顯示MnDRE4A基因的啟動(dòng)子能夠響應(yīng)這4種脅迫。將35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的MnDRE4A基因表達(dá)框?qū)氲綗煵莼蚪M中，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的保水能力顯著高于野生型，經(jīng)過(guò)高溫、低溫、高鹽和干旱4種脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系和葉片黃化和萎蔫程度明顯低于野生型。取處理后植株的葉片測(cè)定脯氨酸、MDA和相對(duì)含水量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因系植株的4種處理的相關(guān)指標(biāo)均顯著不同于野生型植株，轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出更好的抗逆性。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法測(cè)定發(fā)現(xiàn)與高溫有關(guān)的基因NtHSP70，NtHSP2在轉(zhuǎn)基因系畑草中均呈顯著下調(diào)的趨勢(shì)。這也暗示MnDRE4A基因是通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)而提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。

3 桑樹(shù)抗低溫機(jī)理研究

3.1 桑樹(shù)抗低溫性相關(guān)生理生化指標(biāo)

桑樹(shù)抗低溫性包括兩個(gè)方面，一是在落葉后冬芽枝條具有耐低溫的能力；二是在生長(zhǎng)期間細(xì)胞抵御冷害的能力。桑樹(shù)深休眠狀態(tài)抗寒性最強(qiáng)，品種間差異較小，而在休眠終期和解除休眠的萌發(fā)期抗寒性顯著降低，且品種間存在較大的差異。許多學(xué)者認(rèn)為，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量大小來(lái)判斷細(xì)胞損傷程度，并把它作為植物抗低溫的生理指標(biāo)[3]。低溫脅迫影響植物體內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡，即增加活性氧如超氧化物自由基、氫氧自由基、單線態(tài)氧等破壞或降低活性氧清除劑如SOD、POD和CAT酶的活性[18]。

3.2 桑樹(shù)抗低溫分子機(jī)理

3.2.1 LEA家族 目前，植物抗寒性研究熱點(diǎn)主要集中在保護(hù)植物細(xì)胞免受水分脅迫傷害的相關(guān)基因及其產(chǎn)物方面，如抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）、胚胎后期富集蛋白（Late embryogenesis abundant protein，LEA）、熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）等。Ukaji等[19]采用雙向電泳技術(shù)從山桑皮層分離出低溫誘導(dǎo)蛋白WAP20及WAP27，研究發(fā)現(xiàn)兩者分別屬于HSPs和LEA家族。陸小平等[20]利用RT-PCR技術(shù)從蒙古桑幼莖克隆得到桑樹(shù)低溫誘導(dǎo)蛋白基因Wap25，該基因?yàn)長(zhǎng)EA基因的成員之一。孫銀蘋[21]獲得4種桑樹(shù)低溫誘導(dǎo)基因WAP27/WAP25同源序列，命名MaWAP，并推測(cè)該序列可能為L(zhǎng)EA家族成員。對(duì)桑樹(shù)低溫誘導(dǎo)基因MaWAP在低溫脅迫過(guò)程中的表達(dá)分析，推測(cè)該基因在桑樹(shù)抗寒機(jī)制中起到一定作用。但由于植物的抗寒性受多基因控制，低溫誘導(dǎo)基因不一定就是抗寒基因，因此該基因在桑樹(shù)的抗低溫機(jī)制中的具體功能尚有待于通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2.2 MAPK家族 張夢(mèng)[15]對(duì)將桑樹(shù)MnMAPK5 轉(zhuǎn)入擬南芥，低溫脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，其可能是通過(guò)降低抗氧化酶的活性和表達(dá)量及相應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增加ROS的積累，降低了對(duì)低溫脅迫的抗性。說(shuō)明MAPK家族基因參與桑樹(shù)低溫脅迫響應(yīng)。

3.2.3 DREB轉(zhuǎn)錄因子 劉雪琴[17]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入桑樹(shù)MnDRE4A基因的擬南芥可響應(yīng)低溫脅迫，同時(shí)將35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的MnDRE4A基因表達(dá)框?qū)氲綗煵莼蚪M中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能提高抗寒性。

4 桑樹(shù)抗旱機(jī)理研究

4.1 桑樹(shù)抗旱性相關(guān)生理生化指標(biāo)

蒸騰作用是植物水分代謝調(diào)節(jié)中最重要的一環(huán)，它對(duì)水分的運(yùn)轉(zhuǎn)狀況和利用效率有著至關(guān)重要的影響。氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率是線性相關(guān)的指標(biāo)，它們的大小是植物水分平衡的重要生理指標(biāo)，是植物調(diào)節(jié)自身水分散失以及適應(yīng)不同的干旱環(huán)境的能力的重要反映。宋紅生等[22]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，桑樹(shù)葉片質(zhì)膜透性會(huì)隨干旱程度增加而增加。

Reddy等[23]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下桑樹(shù)的細(xì)胞膜膜脂出現(xiàn)了過(guò)氧化反應(yīng)，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性受到了影響，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外漏增多；桑樹(shù)的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、愈創(chuàng)木酚法過(guò)氧化物酶（POD）和谷胱甘肽還原酶（GR）這4種抗氧化酶的活性均有所提高，其提高幅度與桑樹(shù)的抗旱能力成正比。在對(duì)K-2、MR-2、BC2-59、TR-10、S-13五種桑樹(shù)的研究中，它們的葉片所含的脫落酸均在干旱脅迫下增加，但是增加幅度有很大差異。干旱脅迫處理組的脫落酸含量比未經(jīng)干旱脅迫的對(duì)照組增加了約為2/3；脫落酸的增長(zhǎng)幅度在品種間是有差異的，抗旱性強(qiáng)的脫落酸含量比抗旱性弱的提高了1.5～2.0倍，認(rèn)為脫落酸可以作為桑樹(shù)抗旱性的指標(biāo)[24]。

正常情況下，桑樹(shù)品種之間的葉片MDA含量沒(méi)有顯著差異，但葉片中MDA的含量隨著干旱脅迫程度的加深逐漸增加[25]。隨干旱的加強(qiáng)，各品種桑樹(shù)的MDA逐漸增加，在整個(gè)干旱脅迫過(guò)程中，MDA的含量及增幅與桑樹(shù)的抗旱性成正比[26]。

脯氨酸（Proline）是植物中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它不僅是生物大分子的保護(hù)劑和羥基的清除劑，還是植物從脅迫條件恢復(fù)到正常過(guò)程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑。冀憲領(lǐng)等[25]研究表明，在干旱脅迫下不同品種的桑樹(shù)葉片中脯氨酸含量都有增加。尤其是抗旱性較強(qiáng)的品種對(duì)干旱反應(yīng)敏感，脯氨酸含量迅速升高，并達(dá)到一個(gè)相對(duì)較高的水平。

4.2 桑樹(shù)抗旱性分子機(jī)理

4.2.1 P5CS基因 在脯氨酸合成過(guò)程中最主要的酶有兩種：P5CS（吡咯啉-5-羧酸合成酶）和P5CR（吡咯啉-5-羧酸還原酶）。童偉[27]通過(guò)同源性克隆，反轉(zhuǎn)錄PCR和cDNA 末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得了桑樹(shù)中P5CS基因的完整序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析P5CS在干旱和鹽脅迫條件下表達(dá)情況：基因表達(dá)量在脅迫條件下都有不同程度的上調(diào)。在干旱脅迫條件下，P5CS基因表達(dá)量先迅速增加，到達(dá)最大之后又迅速降低。并將正常生長(zhǎng)和處于干旱脅迫下的桑樹(shù)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到54 736個(gè)片段，1 051個(gè)基因在兩種植株上共同顯著表達(dá)，產(chǎn)生大量SSR分子標(biāo)記，為后期發(fā)掘抗旱關(guān)聯(lián)基因和構(gòu)建桑樹(shù)遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)。endprint

4.2.2 MAPK家族 魏從進(jìn)[16]發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)MAPK基因可以受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)MAPK家族基因MnMAPK6植株表現(xiàn)對(duì)干旱敏感。張夢(mèng)[15]對(duì)MnMAPK5轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，其可能主要是通過(guò)降低抗氧化酶的活性和表達(dá)量及相應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增加ROS的積累，降低了對(duì)干旱（PEG）脅迫的抗性。

4.2.3 DREB轉(zhuǎn)錄因子 劉雪琴[17] 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入桑樹(shù)MnDRE4A基因的擬南芥可響應(yīng)干旱脅迫，同時(shí)將35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的MnDRE4A基因表達(dá)框?qū)氲綗煵莼蚪M中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法測(cè)定發(fā)現(xiàn)與植物失水相關(guān)的基因NtERD10B，NtERD10C，NtERD10D呈顯著下調(diào)的趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能提高抗旱性。

5 桑樹(shù)耐鹽機(jī)理研究

5.1 桑樹(shù)耐鹽性相關(guān)生理生化指標(biāo)

鹽脅迫是由滲透脅迫和離子脅迫組成的。在鹽脅迫下，植物的外部形態(tài)和內(nèi)部的生理生化特性都發(fā)生了一系列的變化。已有的研究結(jié)果表明，受鹽脅迫的桑樹(shù)可通過(guò)抑制地上部分的生長(zhǎng)來(lái)減少對(duì)水分的需求和丟失，同時(shí)增加脯氨酸和可溶性總糖的積累，大量吸收Na+、C1-作為滲透溶質(zhì)，來(lái)滿足細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的調(diào)節(jié)需要。湯章城[28]發(fā)現(xiàn)植物在鹽漬條件下所發(fā)生的游離脯氨酸的積累，在一定程度上反映了植物受鹽分脅迫的情況和植物對(duì)鹽分的忍耐和抵抗力，因此可以用葉片內(nèi)脯氨酸含量的增加來(lái)反映桑樹(shù)受鹽分脅迫狀況[3]。

5.2 桑樹(shù)耐鹽性分子機(jī)理

5.2.1 MAPK家族基因 魏從進(jìn)[16]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MAPK基因家族轉(zhuǎn)MnMAPK6基因植株表現(xiàn)出對(duì)高鹽和H2O2的耐受性提高。張夢(mèng)[15]對(duì)MnMAPK5轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫處理后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株可能主要是通過(guò)降低抗氧化酶的活性和表達(dá)量及相應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增加ROS的積累，降低了對(duì)NaCl抗性。

5.2.2 DREB轉(zhuǎn)錄因子 劉雪琴[17]將35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的MnDRE4A基因表達(dá)框?qū)氲綗煵莼蚪M中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能提高耐鹽性。

6 桑樹(shù)抗病機(jī)理研究

王旭煒[29]從桑樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得PAMP途徑相關(guān)的14個(gè)LysM蛋白基因、56個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子、20個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因家族含有各自保守的蛋內(nèi)質(zhì)序列，其中一些蛋白質(zhì)和已報(bào)道過(guò)的蛋白序列高度相似，并且上游調(diào)控序列中都含有一些響應(yīng)植物免疫（JA、SA、真菌、刺激、傷口）的調(diào)控元件，認(rèn)為這些基因可能參與植物的防御免疫反應(yīng)。王曉紅等[30]利用川桑基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，克隆了桑樹(shù)的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因，并對(duì)該基因的生物功能進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶活性，也可抑制菌絲侵染油菜葉片。Lü等[31]克隆了桑椹肥大型菌核病菌的纖維素酶基因CsCelA，過(guò)表達(dá)CsCelA，并對(duì)纖維素酶進(jìn)行分析，推測(cè)CsCelA是桑椹肥大型菌核病菌侵染的主要致病基因。張華梁等[32]克隆得到桑樹(shù)病程相關(guān)PR1蛋白家族基因MuPR1-2，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MuPR1-2定位于細(xì)胞壁或分泌到細(xì)胞間隙。轉(zhuǎn)入MuPR1-2基因的擬南芥對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種和灰霉菌具有較強(qiáng)的抵抗能力，表明MuPR1-2在植物防御功能中具有重要作用。何利[33]根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，篩選出5個(gè)NBS類家族基因，同時(shí)利用青枯菌侵染桑樹(shù)抗/感性品種，分析抗病基因在抗/感性品種侵染前后的表達(dá)量變化情況，CL93、Unigene26173基因可能跟抗病有一定相關(guān)性。Checker等[34]用印度桑的葉和根（處于非生物脅迫中）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得2 400個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），組裝成148個(gè)contig和1 420個(gè)singleton。在EST中檢測(cè)到大量的EST-SSR分子標(biāo)記，可用于后續(xù)桑樹(shù)功能基因組學(xué)的研究。從基因功能注釋發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞代謝過(guò)程有大量保守基因的存在，是桑樹(shù)新功能基因發(fā)掘的基礎(chǔ)。Dai等[35]用Illumina RNA-seq技術(shù)對(duì)桑樹(shù)根和葉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共得到105 000 000個(gè)reads，60 069個(gè)Unigene，從轉(zhuǎn)錄組得到的數(shù)據(jù)中開(kāi)發(fā)了10 268個(gè)SSR分子標(biāo)記，為后期分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及引物篩選、分子育種實(shí)驗(yàn)及桑樹(shù)遺傳圖譜構(gòu)建奠定研究。

7 展望

在過(guò)去的十年里，隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，關(guān)于桑樹(shù)優(yōu)勢(shì)性狀的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)取得了巨大的進(jìn)步，可對(duì)控制關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的基因進(jìn)行功能分析、定位、克隆和轉(zhuǎn)化，闡明分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，加速選育桑樹(shù)新品種。同時(shí)，大量研究表明，桑樹(shù)是比較理想的外源基因受體，已有抗菌肽基因、大豆球蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因和GUS基因成功轉(zhuǎn)入桑樹(shù)組織細(xì)胞[36，37]。因此，可通過(guò)深度挖掘自然界的抗性資源，選育經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的抗逆桑樹(shù)品種。但是想要實(shí)現(xiàn)在分子水平上選育抗逆品種還需要解決幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。最大的問(wèn)題是實(shí)驗(yàn)室和田間環(huán)境的差異。很多研究只在短期內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行某種抗逆性檢測(cè)，然而植物在田間會(huì)同時(shí)受到多種脅迫，有時(shí)候脅迫會(huì)伴隨整個(gè)生長(zhǎng)階段[38]。另外，Dinneny等[39]研究表明根部不同分化程度的細(xì)胞對(duì)不同的非生物脅迫反應(yīng)不同，說(shuō)明不同類型的細(xì)胞對(duì)非生物脅迫響應(yīng)不同。人類對(duì)于植物整個(gè)抗逆認(rèn)識(shí)是有限的，為了能系統(tǒng)認(rèn)識(shí)整個(gè)機(jī)制，需要研究不同分化的細(xì)胞、組織和器官對(duì)逆境的響應(yīng)，需要運(yùn)用系統(tǒng)的生物學(xué)和數(shù)學(xué)生物學(xué)方法整合數(shù)據(jù)來(lái)描述桑樹(shù)抗逆的完整圖像。為了培育非生物、生物抗性及高產(chǎn)量作物，除了認(rèn)識(shí)植株的抗逆響應(yīng)機(jī)制，還必須了解它的能量調(diào)控、代謝調(diào)控、發(fā)育等過(guò)程，集成所有這些信息有利于尋找合適的點(diǎn)來(lái)進(jìn)行育種（圖4）。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蘇 超，焦 鋒.桑樹(shù)的遺傳變異特點(diǎn)及在品種選育中的應(yīng)用[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（6）：1089-1092.endprint

[2] 黎小萍，陳華玲.桑樹(shù)的綜合開(kāi)發(fā)與利用[J].蠶桑通報(bào)，2001， 32（3）：49-51.

[3] 馬建平，牟志美. 桑樹(shù)抗逆性研究進(jìn)展[J].北方蠶業(yè)，2006，27（2）：5-7.

[4] HE N，ZHANG C，QI X，et al.Draft genome sequence of the mulberry tree Morus notabilis[J].Nature Communication，2013， 4（9）：2445.

[5] WANG N，GUO T，SUN X，et al. Functions of two Malus hupehensis（Pamp.） Rehd. YTPs （MhYTP1 and MhYTP2） in biotic-and abiotic-stress responses[J].Plant Science，2017，261：18-27.

[6] HU W，DING Z，TIE W，et al. Comparative physiological and transcriptomic analyses provide integrated insight into osmotic，cold，and salt stress tolerance mechanisms in banana[J].Scientific Reports，2017，7：43007.

[7] HIRAYAMA T，SHINOZAKI K. Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era：Past，present and future[J].The Plant Journal，2010，61（6）：1041-1052.

[8] 李昭良.不同桑樹(shù)品種莖葉解剖結(jié)構(gòu)的耐旱性特征研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[9] CRAMER G R，URANO K，DELROT S，et al. Effects of abiotic stress on plants：a systems biology perspective[J].BMC Plant Biology，2011，11（1）：163.

[10] 于新海，李 濛，周紅昕.植物非生物脅迫的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2016，36（9）：51-53.

[11] 于 娜. 桑樹(shù)病程相關(guān)基因非表達(dá)子基因MuNPR1的生物學(xué)功能研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[12] JONES J D，DANGL J L. The plant immune system[J].Nature. 2006，444（7117）：323-329.

[13] 商侃侃，張德順，王 鋮.高溫脅迫下植物抗性生理研究進(jìn)展[J]. 園林科技，2008（1）：1-5.

[14] 盧承瓊.桑樹(shù)小分子熱激蛋白基因家族分析與功能研究[D].重慶：西南大學(xué)，2015.

[15] 張 夢(mèng).桑樹(shù)促分裂原活化蛋白激酶5（MnMAPK5）基因的功能研究[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

[16] 魏從進(jìn).桑樹(shù)MAPK基因家族信息分析與功能研究[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

[17] 劉雪琴.不同桑樹(shù)雜交組合耐鹽耐旱性及MnDREB4功能研究[D].重慶：西南大學(xué)，2015.

[18] 楊 梅.15個(gè)果桑品種抗寒性研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[19] UKAJI N，KUWABARA C，TAKEZAWA D，et al. Accumulation of small heat-shock protein homologs in the endoplasmic reticulum of cortical parenchyma cells in mulberry in association with seasonal cold acclimation[J].Plant Physiology，1999， 120（2）：481-490.

[20] 陸小平，劉嘉琦，李葉峰，等.桑樹(shù)低溫誘導(dǎo)基因Wap25的序列分析及表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（2）：209-213.

[21] 孫銀蘋，沈智超，雷 朋，等.桑樹(shù)低溫誘導(dǎo)基因Wap在不同地理來(lái)源桑品種幼葉中的表達(dá)差異[J].蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（5）：772-776.

[22] 宋紅生，徐靜斐.干旱對(duì)桑樹(shù)質(zhì)膜透性脯氨酸積累的影響[J].蠶業(yè)科學(xué)，1992，18（2）：65-70.

[23] REDDY AR，CHAITANYA K，SUNDAR D. Water stress-mediated changes in antioxidant enzyme activities of mulberry （Morus alba L.）[J].The Journal of Sericultural Science of Japan，2000，69（3）：169-175.

[24] REDDY AR，CHAITANYA K，JUTUR P，et al. Differential antioxidative responses to water stress among five mulberry （Morus alba L.） cultivars[J]. Environmental and experimental botany，2004，52（1）：33-42.endprint

[25] 冀憲領(lǐng)，蓋英萍，牟志美等.干旱脅迫對(duì)桑樹(shù)生理生化特性的影響[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（2）：117-122.

[26] 時(shí)連輝，牟志美，姚 健.不同桑樹(shù)品種在土壤水分脅迫下膜傷害和保護(hù)酶活性變化[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（1）：13-17.

[27] 童 偉.桑樹(shù)干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和P5CS基因的克隆及表達(dá)分析[D].江蘇鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2013.

[28] 湯章城.逆境條件下植物脯氨酸的累積及其可能的意義[J].植物生理學(xué)報(bào)，1984（1）：17-23.

[29] 王旭煒.桑樹(shù)PAMP途徑中相關(guān)基因分析和功能研究[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

[30] 王曉紅，朱攀攀，梁燕梅，等.桑樹(shù)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（MaPGIP1）的克隆及功能分析[J].作物學(xué)報(bào)，2015，41（9）：1361-1371.

[31] L？譈 R，ZHAO A，LI J，et al. Screening，cloning and expression analysis of a cellulase derived from the causative agent of hypertrophy sorosis scleroteniosis，Ciboria shiraiana[J].Gene，2015， 565（2）：221-227

[32] 張華梁，王 紅，劉 琪，等.桑樹(shù)病程相關(guān)蛋白基因MuPR1-2的克隆及功能分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2015，41（6）：979-988.

[33] 何 利.桑樹(shù)NBS類抗病基因的克隆與表達(dá)分析[D].江蘇鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué)，2014.

[34] CHECKER VG，SAEED B，KHURANA P. Analysis of expressed sequence tags from mulberry（Morus indica） roots and implications for comparative transcriptomics and marker identification[J].Tree Genetics & Genomes，2012，8（6）：1437-1450.

[35] DAI F，TANG C，WANG Z，et al. De novo assembly，gene annotation，and marker development of mulberry （Morus atropurpurea） transcriptome[J].Tree Genetics & Genomes，2015，11（2）：1-11.

[36] MACHII H. Leaf disc transformation of mulberry plant （Morus alba L.） by Agrobacterium Ti plasmid[J].The Journal of Sericultural Science of Japan，1990，59（2）：105-110.

[37] 王鈺婷，汪泰初，李瑞雪，等.桑樹(shù)分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（12）：153-155.

[38] MITTLER R. Abiotic stress， the field environment and stress combination[J].Trends in Plant Science，2006，11（1）：15-19.

[39] DINNENY JR，LONG TA，WANG JY，et al. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress[J].Science，2008，320（5878）：942-945.endprint