吳玉英, 王曉華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州醫(yī)院 常州市第二人民醫(yī)院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003)

慢性阻塞性肺疾病對單個核細(xì)胞TLR2/4信號通路的影響

吳玉英, 王曉華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州醫(yī)院 常州市第二人民醫(yī)院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003)

目的觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)組患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC) TLR2/TLR4、IRAK and NF-κB mRNA水平的變化。方法利用Ficoll分離法分離健康人及COPD組患者外周血單個核細(xì)胞，通過qPCR的方法檢測健康人及COPD患者的TLR2/TLR4、IRAK、NF-κB mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果COPD組單核細(xì)胞TLR2、TLR4 mRNA水平較健康人未見明顯變化，但IRAK1/4以及NF-κB mRNA水平的變化相對健康對照組顯著下降(P<0.05)。結(jié)論TLR2/4信號通路的表達(dá)下調(diào)參與了COPD疾病進展。

慢性阻塞性肺疾病; Toll 樣受體2/4; IRAK; NF-κB

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以呼出氣流持續(xù)受限為主要病理生理特征、慢性氣道炎癥反應(yīng)為主要病理改變的臨床常見病及多發(fā)病[1-2]。沈?qū)幍萚3]在研究細(xì)菌感染與免疫在COPD發(fā)病進程中的作用機制時發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌感染、香煙暴露等致病因素誘導(dǎo)下，Toll樣受體等模式識別受體被激活，啟動固有免疫，激活T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮繼發(fā)性免疫學(xué)效應(yīng)，參與肺組織的損傷與破壞。還有研究者[4]在對人體和小鼠實驗研究中證實，香煙煙霧的顆粒成分可以激活TLR4，可能是由TLR樣受體直接識別煙霧的顆粒成分，也可能是煙霧導(dǎo)致上皮細(xì)胞的損傷，進而被PRRs識別。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取5名健康志愿者，均為男性，平均年齡35歲; 5名COPD組患者，均為男性，平均年齡71歲，因急性加重住院治療，分組根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2015版)》。

1.2 主要試劑

Trizol購自上海普飛; M-MLV、Rnase Inhibitor以及dNTPs購自promega; oligo dT購自上海生工; Bulge-Loop TM miRNA qPCR Primer Set購自廣州銳博; Primer(R&F) 由上海吉凱設(shè)計及合成; SYBR Master Mixture購自 TAKARA。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細(xì)胞的提取: 抽取正常人及COPD患者外周血10 mL, 肝素抗凝，通過Ficoll Hypaque密度梯度離心法(2 000 r/min離心30 min)后吸取白膜層細(xì)胞, PBS洗滌2次(1 500 r/min離心10 min)，獲得單個核細(xì)胞。

1.3.2 TLR 2、TLR4、IRAK 1、IRAK 4、NF-KB mRNA表達(dá)檢測: ① RNA提取: 細(xì)胞收集入15 mL離心管中，隨后12 000 g、4℃離心10 min，棄上清; 加入1～2 mL Trizol混勻后靜置5 min, 隨后12 000 g 4 ℃離心5 min; 取上清液加入各干凈EP管，加入氯仿200 μL后充分振蕩混勻，隨后靜置5 min, 12 000 g、4 ℃離心15 min后取上清加入等比異丙醇，充分混勻; 隨后靜置10 min, 12 000 g 4℃離心10 min; 此時會出現(xiàn)RNA異丙醇沉淀，棄上清，加入DEPC水處理的75%乙醇1 mL; 隨后12 000 g 4 ℃離心5 min; 棄乙醇，空氣靜置2～5 min干燥沉淀，最后加入RNase-free H2O 10 μL溶解沉淀。② 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng): 反應(yīng)體系: 5×Primerscript Mix Buffer 2 μL, RNA(根據(jù)測定的RNA的濃度決定使用的具體計量，每10 μL體系最多轉(zhuǎn)錄500 ng RNA), RNase free H2O, 共10 μL體系，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min(逆轉(zhuǎn)錄), 85 ℃ 5 s(酶失活)。③ Real Time PCR反應(yīng): 引物設(shè)計: 內(nèi)參基因GAPDH，上游引物序列TGACTTCAACAGCGACACCCA, 下游引物序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA, 擴增片段大小121 bp; 目的基因IRAK1，上游引物序列TGAGGAACACGGTGTATGCTG, 下游引物序列GTTTGGGTGACGAAACCTGGA, 擴增片段大小119 bp; 目的基因TLR2, 上游引物序列CGGAAGATAATGAACACCAAGAC, 下游引物序列AGATCCCAACTAGACAAAGACTG, 擴增片段大小139 bp; 目的基因NFKB1, 上游引物序列AGGATTTCGTTTCCGTTATGT, 下游引物序列CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC, 擴增片段大小92 bp; 目的基因IRAK4, 上游引物序列CCTGACTCCTCAAGTCCAGAA，下游引物序列ACAGAAATGGGTCGTTCATCAAA，擴增片段大小119 bp; 目的基因TLR4, 上游引物序列CCTGTCCCTGAACCCTATGA，下游引物序列CTTCTAAACCAGCCAGACCTT, 擴增片段大小137 bp。④ 反應(yīng)體系: SYBR Green I Mix 10 μL, 引物上下游各0.4 μL, cDNA 1.2 μL, 加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s共40個循環(huán); 融解曲線反應(yīng)條件為: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2-△△CT方法分析基因相對表達(dá)量(即表示實驗組目的基因的表達(dá)相對于對照組變化的倍數(shù))?！鰿T=目的基因CT值-管家基因CT值, △△CT=實驗組的△CT值-對照組的△CT值(即△△CT=刺激后目的基因的△CT值-刺激前目的基因的△CT值)，相對量RQ=2-△△CT。凝膠電泳: 用含有5 μL 0.1%溴乙錠的3%瓊脂糖凝膠跑電泳分析PCR的終產(chǎn)物。DNA條帶用Tanon 3500凝膠電泳成像系統(tǒng)進行顯效。

2 結(jié) 果

2.1 COPD組患者TLR2和TLR4 mRNA的變化

作者收集COPD組患者和健康者外周血單個核細(xì)胞提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4 mRNA的表達(dá)變化，利用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖1所示。COPD組TLR2 mRNA對比健康對照組的RQ值=1.214±0.184,P=0.282,n=5; COPD組TLR4 mRNA對比健康對照組的RQ值=0.913±0.172,P=0.626,n=5。2組在TLR2及TLR4 mRNA的表達(dá)水平無顯著差異。

2.2 COPD組患者IRAK1/4和NF-κB mRNA的 變化

作者收集COPD組患者和健康者外周血單個核細(xì)胞提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測IRAK1、IRAK4以及NF-κB mRNA的表達(dá)變化，利用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖2所示。COPD組IRAK1/4以及NF-κB mRNA對比健康對照組的RQ值分別為(0.641±0.107)、(0.3 798±0.095)、(0.3 356±0.097) (P<0.05,n=5)。結(jié)果顯示, COPD患者的IRAK以及NF-κB的mRNA顯著減少。

圖1 COPD組及健康對照組TLR2、TLR4 mRNA水平的表達(dá)

3 討 論

研究[5]結(jié)果顯示, TLR參與了持續(xù)炎癥反應(yīng)，但目前對TLR信號通路的研究還較為表淺，值得進一步深入基礎(chǔ)研究。TLRs是最主要的天然免疫識別受體，在肺部存在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，均表達(dá)TLR, 不同細(xì)胞主要表達(dá)的TLR不同。肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7及TLR8, 漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞表達(dá)TLR9及TLR7, 髓樣樹突狀細(xì)胞則表達(dá)TLR1～TLR4。通過激活細(xì)胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，啟動天然免疫應(yīng)答[6]。目前的研究[7]多集中于TLR2及TLR4，尤其是TLR4。TLR2識別的PAMPs非常廣泛，包括病毒，細(xì)菌以及寄生蟲等。TLR4主要識別革蘭陰性菌脂多糖(LPS)、呼吸道合胞病毒等。有研究者[8]收集因肺鱗癌行肺葉切除的癌旁組織標(biāo)本50例，根據(jù)肺功能分為COPD組和非COPD組，研究結(jié)果顯示 COPD組患者肺血管管壁及周圍大量炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間質(zhì)增多，管腔狹窄，平滑肌細(xì)胞增生肥大，出現(xiàn)明顯的肺血管重建，而且通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)COPD組TLR4在肺動脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于非 COPD組，進一步支持TLR4信號通路參與了持續(xù)的炎癥反應(yīng)。

還有研究者以AECOPD患者體內(nèi)單核細(xì)胞衍生的肺泡巨噬細(xì)胞作為模型，結(jié)果顯示基礎(chǔ)狀態(tài)下AECOPD患者TLR4、NF-KB mRNA和蛋白表達(dá)及上清中TNF-α水平均顯著高于健康對照，表明AECOPD患者可能受到定植菌的長期刺激，巨噬細(xì)胞通過TLR4識別，使NF-KB處于活化狀態(tài)，炎癥因子TNF-α明顯增高，使氣道炎癥持續(xù)[9]。Tohn等[10]研究顯示COPD患者外周血單個核細(xì)胞表面TLR2、TLR4的表達(dá)水平與血清TNF-α、IL-6、IL-8的濃度成正相關(guān)。TLR-2主要在肺組織的肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)，而不同的是, Kuroki等[11]研究發(fā)現(xiàn)長期受LPS刺激的單核細(xì)胞TLR-2表達(dá)下調(diào)，并且隨著LPS的刺激時間越長TLR-2表達(dá)下調(diào)越明顯。Droemanm[12]研究則發(fā)現(xiàn)COPD患者和健康吸煙者肺泡巨噬細(xì)胞表面TLR-2表達(dá)明顯降低，在受到LPS刺激時非吸煙者的肺泡巨噬細(xì)胞出現(xiàn)TLR-2表達(dá)呈下調(diào)趨勢。IRAK家族是TLRs/IL-1信號通路中的信號通路連接體和樞紐，基本上所有的TLRs信號通路都需要與它們連接，其中最重要的連接體是IRAK1和IRAK4?，F(xiàn)有研究[13]表明IRAK1和IRAK4因具有激酶活性，在信號通路中起著正性調(diào)節(jié)的作用。

本研究結(jié)果顯示, COPD組患者TLR2及TLR4在mRNA水平的表達(dá)與健康人無顯著差異，但IRAK1/4及NF-κB mRNA水平的表達(dá)卻顯著下降，這與前提及的研究結(jié)果存在一定的差異。眾所周知，當(dāng)機體受到病原體感染時，炎癥反應(yīng)是人體進行抵抗的首要反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可以激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并通過此種應(yīng)答來解決問題和恢復(fù)體內(nèi)的動態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示, COPD組患者TLR信號通路受到了抑制，那么必然影響炎癥反應(yīng)的表達(dá)。另外，此部分患者均存在慢性缺氧，長期缺氧后可導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞能量代謝異常，進而影響了信號通路的傳導(dǎo)，甚至可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

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Influenceofchronicobstructivepulmonarydiseaseontheexpressionoftoll-likereceptor2/4signalpathwayofperipheralbloodmononuclearcells

WUYuying,WANGXiaohua

(RespiratoryDepartment,TheSecondHospitalofChangzhou,ChangzhouAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ObjectiveTo investigate the expression changes of toll-like receptor 2/4 (TLR 2/4), IRAK and NF-κB mRNA on monocyte-derived dendritic cells of patients with chronic obstructive pulmonary disease.MethodsFicoll separation was been used to separate peripheral blood mononuclear cells of the healthy controls and patients with COPD. The expression levels of TLR2/TLR4, IRAK and NF-κB mRNA were detected for healthy controls and patients with COPD by the method of qPCR.ResultsThe expression of TLR2 and TLR4 mRNA in COPD group were similar to healthy people, but IRAK1/4 and the NF-κB mRNA expression levels were significantly lower than the healthy controls.ConclusionThe download expression of TLR2/4 signaling pathways play an important role in the progression of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease; toll-like receptor 2/4; IRAK; NF-κB

R 441.8

A

1672-2353(2017)24-016-03

10.7619/jcmp.201724005

2017-07-22

王曉華, E-mail: xiaohuawang001@foxmail.com