孫高軍, 洪深求, 周小兵, 方紅美, 章俊鵬, 周存六

(1.安徽省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站,安徽 合肥 230009; 2.合肥工業(yè)大學 食品科學與工程學院,安徽 合肥 230009)

廢次煙葉多糖綠色提取工藝的研究

孫高軍1, 洪深求1, 周小兵1, 方紅美2, 章俊鵬2, 周存六2

(1.安徽省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站,安徽 合肥 230009; 2.合肥工業(yè)大學 食品科學與工程學院,安徽 合肥 230009)

廢次煙葉富含多糖具有十分重要的開發(fā)價值。文章研究了熱水浸提煙葉多糖的提取工藝,考察浸提料液比、時間、溫度和浸提劑乙醇體積分數(shù)對煙葉多糖提取率的影響,在其基礎上進行正交試驗。結(jié)果表明，影響熱水浸提煙葉多糖提取率的主次因素依次為浸提劑乙醇體積分數(shù)、溫度、料液比、浸提時間。熱水浸提煙葉多糖的最優(yōu)組合條件為:浸提劑為蒸餾水,溫度為80 ℃,料液比為1∶60,時間為30 min。上述條件下連續(xù)提取2次,多糖提取率可達4.08%。在該工藝條件下,煙葉多糖的提取率與微波提取法相當。該工藝不涉及微波、超聲波等輔助設備和有機溶劑的使用,具有操作方便、成本低、環(huán)保等優(yōu)勢。

廢次煙葉;多糖;綠色提取;工藝研究

植物多糖是一類由醛糖或酮糖通過縮合而成的、具有多種生物活性功能的天然高分子聚合物[1-2],在藥品、食品以及精細化工品等方面具有廣泛的應用前景[3-4]。植物多糖的提取與純化、生物活性及其應用已成為近年來的研究熱點之一[5]。

據(jù)統(tǒng)計,我國每年煙葉產(chǎn)量約450～500萬噸,在煙葉采摘、加工過程中,將產(chǎn)生30%以上的煙葉、煙末和煙梗等下腳料[6-7]。這些廢次煙葉富含多糖,是植物多糖的重要來源。目前主要采用超聲波[7-9]、微波[10]、醇提[10]等技術手段提高廢次煙葉多糖的提取率，但超聲波、微波等難以實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn),醇提方法存在環(huán)保和成本高等問題。鑒于上述原因,我國廢次煙葉尚未得到有效利用,大部分被廢棄,造成資源的重大浪費與環(huán)境的嚴重污染。開發(fā)綠色、有效的多糖提取方法是提高廢次煙葉綜合利用的一個重要途徑。

針對上述問題,本文探索了熱水浸提煙葉多糖的工藝條件,可為廢次煙葉資源的綠色開發(fā)利用提供技術支持和理論指導,并且該工藝條件可延伸到過剩煙葉的應用上,為過剩煙葉謀求新的綜合利用途徑提供思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

廢次煙葉、無水乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、活性炭。所有試劑均為分析純。

1.2 煙葉多糖提取方法

取1 g煙葉粉末放入燒杯中,按一定的液料比,加入一定體積和溫度的蒸餾水,在設定的浸提劑乙醇體積分數(shù)、浸提時間和浸提溫度條件下進行提取。提取結(jié)束后,在8 000 r/min、 4 ℃條件下離心15 min,取上清液,于65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至體積的1/5。取濃縮液,加入體積為濃縮液4倍的無水乙醇,于4 ℃醇析過夜。再經(jīng)5 000 r/min離心15 min,取多糖沉淀。多糖沉淀再次用蒸餾水溶解,隨后采用Sevage法脫蛋白。

Sevage 法脫蛋白[11]。取上述煙葉多糖溶液溶于1/3體積氯仿和正丁醇的混合液(氯仿與正丁醇的體積比為 5∶1),磁力攪拌 30 min離心,取上層水相;重復上述操作,直到兩相間無明顯的蛋白沉淀為止。水相溶液即為煙葉粗多糖溶液。

1.3 熱水浸提法提取煙葉多糖的的試驗方案

(1) 料液比(A)。取1 g煙葉,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,在60 ℃下浸提30 min,研究料液比對煙葉多糖提取率的影響。

(2) 時間(B)。取1 g煙葉,料液比為1∶20,在60 ℃下分別熱水浸提20、30、40、50、60 min,研究浸提時間對煙葉多糖提取率的影響。

(3) 溫度(C)。取1 g煙葉,料液比為1∶20,分別在40、50、60、70、80 ℃下浸提30 min,研究浸提溫度對煙葉多糖提取率的影響。

(4) 浸提劑乙醇體積分數(shù)(D)。取1 g煙葉,料液比為1∶20,乙醇體積分數(shù)分別為0%、15%、30%、45%、60%,在60 ℃下浸提30 min,研究浸提劑乙醇體積分數(shù)對煙葉多糖提取率的影響。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇A、B、C、D 4個因素進行L9(34)正交試驗。

1.4 熱水浸提次數(shù)對煙葉多糖提取率的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果,在最優(yōu)條件下對廢次煙葉進行2次萃取,分別測定每次煙葉多糖的提取率,分析浸提次數(shù)對煙葉多糖提取率的影響。

1.5 微波輔助提取法與熱水浸提法的比較

比較最優(yōu)條件下熱水浸提法與微波輔助提取法的煙葉多糖提取率。根據(jù)試驗結(jié)果,選擇的微波輔助提取條件為:微波功率450 W,時間40 min,料液比1∶20,溫度70 ℃。

1.6 多糖質(zhì)量濃度的測定

采用苯酚硫酸法[7]測定多糖的質(zhì)量濃度。

(1) 制作標準曲線。準確稱取葡萄糖標準品10 mg放入燒杯中溶解,轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于試管中,加蒸餾水補至1.0 mL,然后再加入5%苯酚0.5 mL及濃硫酸5.0 mL,在漩渦振蕩器上震蕩均勻,放入沸水浴中,保溫15 min后取出,再放入水浴中冷卻15 min。以加入0 mL萄糖標準液的反應液作為空白對照調(diào)零,于490 nm下測各反應液的吸光度值并記錄。橫坐標為葡萄糖質(zhì)量濃度,縱坐標為吸光度值,以此繪制標準曲線。

(2) 煙葉多糖提取率的計算。取1 mL脫蛋白后所得的煙葉多糖溶液,稀釋一定倍數(shù)。取3 mL稀釋后溶液于試管中,分別加入0.5 mL 5%的苯酚和5 mL濃硫酸,余下操作同制作標準曲線的方法。測定并記錄反應液在490 nm的吸光度值,測3次,取平均值,并通過標準曲線的公式反推其相應的煙葉多糖提取率。

根據(jù)所得糖標準曲線,由苯酚-硫酸法測定多糖溶液的吸光度A,可以計算出反應液中多糖的質(zhì)量濃度ρ。然后由下式計算煙葉多糖的提取率，即

K=(ρnV/m)×100%,

其中,K為多糖提取率;ρ為反應液中多糖質(zhì)量濃度;N為多糖浸提劑的稀釋倍數(shù);V為多糖浸提劑的體積;m為所用煙葉質(zhì)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel 程序計算出平均值及相應的標準差,結(jié)果以(均值±標準差)表示;單因素試驗數(shù)據(jù)間的顯著性采用t檢驗計算,P<0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)1.6的實驗方法,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線如圖1所示,吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度呈線性關系,線性方程為y=7.427 8x+0.006 6,R2=0.990 6。以此作為標準曲線,可計算煙葉多糖的提取率。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.1 熱水浸提法單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸提料液比對煙葉多糖提取率的影響

浸提料液比對煙葉多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 浸提料液比對煙葉多糖提取率的影響

由圖2可以看出,料液比低于1∶50時,隨著料液比的增加,煙葉多糖的提取率顯著增加(P<0.05);在料液比為1∶50時,提取率達到最大值;料液比超過1∶50時,隨著料液比的增加,煙葉多糖的提取率顯著下降(P<0.05)?？赡苁怯捎诹弦罕忍r,煙葉多糖不能充分溶解,導致提取率低;隨著料液比的增加,煙葉充分溶脹,利于多糖的溶出,提取率增加。

2.1.2 時間對煙葉多糖提取率的影響

時間對煙葉多糖提取率的影響如圖3所示,由圖3可看出,隨浸提時間的增加,煙葉多糖的提取率總體呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,在40 min時,提取率顯著增加(P<0.05)達到最大值。提取過程本質(zhì)上是原料中的被提取物溶解于浸提劑的過程;該過程中被提取物必須與浸提劑接觸并發(fā)生作用。因此,浸提劑滲透至原料的內(nèi)部以及被提取物在浸提劑中溶解達到平衡需要一定的時間。這可能是在小于40 min內(nèi)煙葉多糖的提取率隨著浸提時間的延長而增加的緣故。另一方面,當浸提時間進一步延長,一些其他水溶性成分也可能被萃取出來,這些成分與煙葉多糖競相與水分子作用,導致煙葉多糖溶解度的下降,從而導致多糖提取率的降低。

圖3 浸提時間對煙葉多糖提取率的影響

2.1.3 溫度對煙葉多糖提取率的影響

溫度對煙葉多糖提取率的影響如圖4所示。

圖4 浸提溫度對煙葉多糖提取率的影響

由圖4可看出,在低于60 ℃時,隨溫度的升高、煙葉多糖提取率的變化不大(P>0.05);與60 ℃時相比，70 ℃時煙葉多糖的提取率有顯著的提高(P<0.05)；與60 ℃時相比，提取溫度為80 ℃時,煙葉多糖的提取率無明顯變化(P>0.05)。通常,提取溫度的升高可能加劇多糖分子的運動、提高多糖的溶解速度,縮短未溶解多糖與多糖溶液之間的平衡時間[12];多糖溶解通常也是一個吸熱過程,溫度升高將推動多糖溶解的方向移動,有利于多糖分子的溶出,從而提高了多糖的提取率[13]。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對煙葉多糖提取率的影響

多糖是一類多羥基醛酮類化合物[14],研究者根據(jù)相似相溶原理選用極性有機溶劑(如乙醇等)作為多糖復合浸提劑的組分,以提高多糖的提取率[10]。乙醇體積分數(shù)對煙葉多糖提取率的影響如圖5所示,由圖5看出,在乙醇體積分數(shù)達到15%之前,提取率略有增加(P>0.05);然而,隨著萃取劑中乙醇體積分數(shù)的進一步提高,煙葉多糖的提取率呈逐漸下降趨勢;與純水作為參照,萃取劑中乙醇體積分數(shù)達到60%、煙葉多糖的提取率明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明,萃取劑中引入乙醇可能導致多糖在水中溶解度的降低,不利于煙葉多糖的提取。一些文獻也報道采用乙醇沉降法提純多糖[7],就是利用向多糖溶液中加入乙醇降低多糖溶解度的原理。由此推測,以純水作為萃取劑可能更有利于煙葉多糖的萃取。

圖5 浸提劑乙醇體積分數(shù)對煙葉多糖提取率的影響

2.2 熱水浸提煙葉多糖的正交試驗結(jié)果

依據(jù)單因素實驗的結(jié)果,選擇A、B、C、D 4個因素、每個因素3個水平,按照L9(34)進行正交試驗。正交試驗結(jié)果見表1所列。

由表1可得,影響熱水浸提煙葉多糖提取率的因素主次順序為D>C>A>B,即浸提劑乙醇體積分數(shù)影響最大,其次是浸提溫度和料液比,浸提時間影響最小。從極差分析看,熱水浸提煙葉多糖的最優(yōu)組合條件為A3B1C3D1,即蒸餾水浸提溫度為80 ℃,料液比為1∶60,時間為30 min。而直觀分析所得最好結(jié)果為第3組試驗,最優(yōu)條件為A3B3C3D1,即蒸餾水浸提溫度為80 ℃,料液比為1∶60,時間為50 min。因此,需要進行驗證實驗,才能確定熱水浸提煙葉多糖的最優(yōu)條件。

驗證試驗結(jié)果表明,按照實驗條件A3B1C3D1進行萃取,多糖的提取率為3.67%,而按照A3B3C3D1試驗條件進行萃取,多糖的提取率為3.31%，因此,熱水浸提煙葉多糖的最優(yōu)條件為A3B1C3D1。

表1 熱水浸提法提取煙葉多糖的正交試驗結(jié)果

熱水浸提法是植物多糖提取的重要方法之一。但由于多糖定量分析未考慮色素、蛋白等雜質(zhì)的干擾,與文獻報道的實驗結(jié)果大相徑庭、缺乏可信度[7，10]。本文以純化多糖產(chǎn)率為依據(jù),研究確定熱水浸提煙葉多糖提取的影響因素和合適工藝條件。由于排除色素、蛋白等雜質(zhì)對多糖定量分析的干擾,試驗結(jié)果更加真實可信。

另外,正交試驗結(jié)果還表明，與乙醇水溶液相比,純水更有利于煙葉多糖的提取,證實了前面的推測。這為純水作為煙葉多糖萃取劑提供了試驗依據(jù)。相比于以乙醇等有機水溶液復合萃取劑,純水作為萃取劑成本低、更環(huán)保。

2.3 浸提次數(shù)對多糖提取率的影響

浸提次數(shù)也是影響多糖提取率的重要因素之一。前面的試驗未考慮該因素對多糖提取率的影響，因此,有必要考察浸提次數(shù)對煙葉多糖的提取率影響。結(jié)果表明:第1次浸提多糖提取率為3.67%,第2次浸提多糖提取率為0.41%,2次浸提多糖總提取率達4.08%。比第1次浸提、第2次浸提的多糖提取率提高了11.1%，因此有必要進行二次浸提。

2.4 微波輔助提取法與熱水浸提法的比較

微波、超聲波是近年來發(fā)展起來的新興技術,分別利用微波能[10]、超聲波的機械效應、空化效應和熱效應來增大介質(zhì)的運動速度和穿透力從而提高提取率[12],已廣泛用于食品加工、天然產(chǎn)物提取等領域[10,12,15]。為了評價熱水浸提法對煙葉多糖提取效率,對最優(yōu)條件下熱水浸提法與微波輔助提取法的煙葉多糖提取率進行比較,結(jié)果表明:熱水浸提法的提取率為(3.62±0.10)%,微波提取法的提取率為(4.75±0.12)%,效果稍優(yōu)于熱水浸提法,但兩者沒有顯著差異(P>0.05)。微波輔助提取法操作復雜、難以實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn),且設備成本高[10],難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此,從工業(yè)化生產(chǎn)來講,更適宜采用熱水浸提法。

3 結(jié) 論

影響熱水浸提煙葉多糖提取率的主次因素為浸提劑乙醇體積分數(shù)、浸提溫度、料液比、浸提時間。熱水浸提煙葉多糖的最優(yōu)工藝條件為:用純水浸提,溫度為80 ℃,料液比為1∶60,時間為30 min。上述條件下連續(xù)提取2次,多糖總提取率可達4.08%。在該工藝條件下,煙葉多糖的提取率與微波提取法相當。本工藝不需要微波、超聲波輔助設備,不涉及有機溶劑的使用和pH值調(diào)節(jié)工序,因而具有綠色、操作方便、成本低等優(yōu)勢。

[1] FLEITA D，EI-SAYED M，RIFAAT D.Evaluation of the antioxidant activity of enzymatically-hydrolyzed sulfated polysaccharides extracted from red algae;Pterocladiacapillacea[J].LWT-Food Science and Technology，2015，63(2)：1236-1244.

[2] CHENG J J，CHANG C C，CHAO C H，et al.Characterization of fungal sulfated polysaccharides and their synergistic anticancer effects with doxorubicin[J].Carbohydrate Polymers，2012，90(1)：134-139.

[3] GIAVASIS I.Bioactive fungal polysaccharides as potential functional ingredients in food and nutraceuticals[J].Current Opinion in Biotechnology，2014，26:162-173.

[4] WANG Y L，ZHAO Y，ANDRAE-MAROBELA K，et al.Tea polysaccharides as food antioxidants：An old woman's tale? [J].Food Chemistry，2013，138(2/3)：1923-1927.

[5] YAO X C，CAO Y，PAN S K，et al.Preparation of peach gum polysaccharides using hydrogen peroxide[J].Carbohydrate Polymers，2013，94(1)：88-90.

[6] 周國生，義勝輝，崔建軍，等.基于生物工程的廢次煙葉資源化技術研究[J].中國煙草科學，2013,34(1)：85-89.

[7] 許春平，楊琛琛，王錚，等.低次煙葉多糖的提取及生物活性分析[J].煙草科技，2013(11)：52-55.

[8] 劉燮，羅健，張燕，等.正交法優(yōu)化廢次煙葉中水溶性多糖提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43(32)：175-177.

[9] 舒俊生，田振峰，陳開波，等.煙葉中多糖的分離及單糖組成[J].食品與機械，2013(3)：34-36.

[10] 杜林洳，徐翠蓮，樊素芳，等.微波輔助提取廢次煙葉水溶性糖工藝[J].科技導報，2010，28(13)：92-96.

[11] 張萍，賀茂萍，殷力，等.石榴皮多糖的Sevage法除蛋白工藝研究[J].食品科技，2013 (12):219-222.

[12] 高彥祥，楊文雄.紅茶湯動力學研究：超微粉碎工藝和溫度對茶湯可溶性固形物成分萃取率的影響[J].食品科學，2005，26(7)：50-52.

[13] 印永嘉，奚正楷，李大珍.物理化學簡明教程[M].北京：高等教育出版社，1992：149-190.

[14] 馬永昆，劉曉庚.食品化學[M].南京：東南大學出版社，2007：29-90.

[15] 孫晨.微波輔助提取食品有效成分研究進展[J].糧食與油脂，2011(7)：5-7.

Studyofgreenextractiontechnologyofpolysaccharidesfromwastetobaccoleaves

SUN Gaojun1, HONG Shenqiu1, ZHOU Xiaobing1, FANG Hongmei2, ZHANG Junpeng2, ZHOU Cunliu2

(1.Anhui Tobacco Quality Supervision and Test Station， Hefei 230009， China; 2.School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology, Hefei 230009， China)

Waste tobacco leaves， which are rich in polysaccharides， have very fundamental development value. In this paper, the extraction technology of polysaccharides from tobacco leaves by hot water extraction was studied, the effect of the ratio of raw tobacco to extraction medium， time， temperature and ethanol concentration of extraction medium on polysaccharides yield was investigated, and then the orthogonal test was conducted. The results showed that the importance for polysaccharides yield decreased in the following order： ethanol concentration of extraction medium， extraction temperature， ratio of raw tobacco to extraction medium and extraction time. The optimum conditions for polysaccharides extraction were established as follows：the extraction medium was distilled water， the extraction temperature was 80 °C， the ratio of raw tobacco to extraction medium was 1∶60 and the extraction time was 30 min. The total polysaccharides yield of twice extraction was up to 4.08% under the presented conditions， which was similar to that under microwave-assisted extraction. This process does not involve in the use of microwave or ultrasonic equipment and organic solvent. So it has the advantages of convenient operation， low cost and environment-friendliness.

waste tobacco leaf; polysaccharide; green extraction; process research

2016-04-29；

2016-09-01

安徽省煙草公司重點資助項目(20150551001);安徽省省級大學生創(chuàng)新資助項目(2015CXCYS080)

孫高軍(1979-),男,安徽巢湖人,博士,安徽省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站高級工程師；

周存六(1970-),男,安徽舒城人,博士，合肥工業(yè)大學教授,碩士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.12.023

Q539

A

1003-5060(2017)12-1704-05

(責任編輯閆杏麗)