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1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2．遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600

產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對巨噬細(xì)胞作用比較

吳琦1張凡2鞠成國1,2*賈天柱1,2

1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2．遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600

目的比較產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對巨噬細(xì)胞的作用差別，探討產(chǎn)地加工一體化黃柏飲片的優(yōu)勢。方法分別以不同濃度產(chǎn)地加工一體化和傳統(tǒng)加工黃柏飲片的生品及其鹽制品藥液作用于小鼠巨噬細(xì)胞，4 h后加入脂多糖刺激，培養(yǎng)24 h后測定上清液中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量，并觀察巨噬細(xì)胞對中性紅吞噬能力的變化。結(jié)果同劑量各組與傳統(tǒng)加工的生黃柏飲片組相比，黃柏鹽炙品以及產(chǎn)地加工一體化黃柏組的TNF-α、IL-6、IL-10和NO水平顯著性(P<0.05)或極顯著性降低(P<0.01)，吞噬能力增強(qiáng)。結(jié)論產(chǎn)地加工一體化黃柏飲片能明顯降低炎癥因子水平，增加巨噬細(xì)胞對中性紅的吞噬能力。

產(chǎn)地加工一體化；巨噬細(xì)胞；脂多糖；吞噬

黃柏味苦、性寒，為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”，具有清熱燥濕、解毒療瘡、瀉火除蒸的功效[1]。目前已有大量關(guān)于川黃柏的化學(xué)成分研究，其化學(xué)成分主要包含生物堿類、酚酸類、黃酮類以及少量檸檬苦素類化合物[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究均表明，黃柏具有解熱、抗炎抗菌、抗?jié)?、降血糖、祛痰?zhèn)咳、抗癌和抗血小板聚集等作用，且對免疫系統(tǒng)和心血管也有一定影響，這與其所含化學(xué)成分有著十分密切的關(guān)系[4]。

黃柏的傳統(tǒng)加工方法是取干黃柏藥材，用水悶潤軟化后再切制成黃柏絲干燥。這種加工方法會使黃柏藥材在悶潤軟化過程中有效成分大量流失，導(dǎo)致黃柏的藥理藥效有所下降。而根據(jù)文獻(xiàn)記載[5-10]，藥材采用產(chǎn)地加工一體化的加工方法，可有效降低化學(xué)成分損失，提高藥效。巨噬細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞之一[11]，實(shí)驗(yàn)對黃柏藥材采用產(chǎn)地加工一體化的加工方法，考察產(chǎn)地加工一體化黃柏與傳統(tǒng)方法加工的黃柏對巨噬細(xì)胞的分泌和吞噬功能的影響，找到產(chǎn)地加工一體化黃柏在抗炎藥效方面的優(yōu)勢，為黃柏飲片的質(zhì)量評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 雙人單面超凈工作臺(上海智成科學(xué)儀器有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本三洋MCO-15AC), METTLERAE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER),酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，TGL-16C型高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，倒置顯微鏡(寧波永新NIB-100)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊科學(xué)儀器有限公司)，-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)，微量移液器(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)，電子天平(上?，幮码娮涌萍加邢薰?，渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)。

1.2 藥物與試劑 黃柏藥材采自四川省滎經(jīng)縣，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。小鼠巨噬細(xì)胞株(貨號：RAW264.7，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo公司)，新生胎牛血清(Thermo公司)，雙抗(青霉素和鏈霉素，Gibco公司)，胰酶(Reanta公司)，PBS(Solarbio公司)，75%醫(yī)用消毒酒精，CCK-8試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，小鼠腫瘤壞死因子-α試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：BPE20220)，小鼠白細(xì)胞介素-6試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：BPE20012)，小鼠一氧化氮試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：BPE20293)，小鼠白細(xì)胞介素-10試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號：BPE20005)，水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 黃柏飲片的制備 傳統(tǒng)生黃柏絲：取干燥的黃柏樹皮，用水悶潤軟化，切制成2～4 mm后干燥。

傳統(tǒng)鹽黃柏絲：取大小均一的傳統(tǒng)加工的生黃柏絲放入容器中，噴入鹽水，拌勻，密閉悶潤2h后取出，在150～160 ℃條件下，置鍋中炒5min，取出放涼，即得。每100 kg黃柏用鹽2 kg，30 L水溶解鹽。

產(chǎn)地加工生黃柏絲：采集黃柏樹皮，趁鮮切制成2～4 mm后干燥。

產(chǎn)地加工鹽黃柏絲：取大小均一的產(chǎn)地加工的生黃柏絲放入容器中，噴入鹽水，拌勻，密閉悶潤2h后取出，在150～160 ℃條件下，置鍋中炒5min，取出放涼，即得。每100 kg黃柏用鹽2 kg，30 L水溶解鹽。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脂多糖(LPS)的配制 精密稱取5 mg脂多糖粉末，用經(jīng)微孔濾膜過濾除菌的高糖培養(yǎng)基DMEM溶解，定容至5 mL，得濃度為1 mg/mL的脂多糖原液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后待用，于冰箱-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 0.1%中性紅的配制 精密稱取0.03 g中性紅粉末，用已過濾除菌的PBS溶解，定容至30 mL，得濃度為0.1%的中性紅溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后待用，于冰箱-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試藥物溶液的配制 精密稱取傳統(tǒng)生黃柏、傳統(tǒng)鹽黃柏、一體化生黃柏、一體化鹽黃柏各8 g，加入80 mL水回流提取1h，取出藥液，再加入80 mL水回流提取1h后取出藥液，合并兩次藥液后過濾，將濾液中的水分蒸干并凍干成粉，用DMEM溶解凍干粉，配制成含生藥濃度為100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的藥液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 培養(yǎng)基的配制 取84 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，15 mL胎牛血清，1 mL雙抗混合，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 RAW264.7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞培養(yǎng)中心，細(xì)胞購回后，用75%酒精棉擦拭細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)，24h后取出，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度大約80%以上，細(xì)胞形態(tài)大多為梭形且貼壁牢固，則開始傳代。

傳代開始時，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用移液槍吸棄瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入2 mL無菌、常溫PBS緩慢清洗兩次，以清除殘余培養(yǎng)基和生長狀態(tài)不好的未貼壁細(xì)胞。然后加入2 mL胰酶，放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化3 min，在顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞回縮，但無脫落為宜，加入3 mL “2.4”項(xiàng)下配制的含血清培養(yǎng)基終止消化，用移液槍將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上的細(xì)胞都沖洗下來，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)離心5min，取出棄去離心管內(nèi)液體，加5 mL含血清培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞打散，然后取10 μL細(xì)胞懸液于顯微鏡下計(jì)數(shù)，用含血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，以1∶2～1∶3的細(xì)胞含量比例傳代，一般傳代時間為2～3d，傳到第三代后，采用處于對數(shù)生長期的生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。傳代前和傳代后的細(xì)胞見圖1。

2.6 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、細(xì)胞刮刮取、培養(yǎng)基內(nèi)吹打后，用含血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.7×106/mL，接種到96孔板上，每孔100 μL細(xì)胞懸液，另留出3個孔不加細(xì)胞懸液，加無血清培養(yǎng)基100 μL作為空白對照組。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去含血清培養(yǎng)液，加入100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞12h，使細(xì)胞周期同步化。棄去無血清培養(yǎng)基，給藥組加入濃度為100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的傳統(tǒng)加工生黃柏，傳統(tǒng)加工鹽黃柏，產(chǎn)地加工一體化生黃柏，產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏藥液100 μL，空白組加入無血清DMEM培養(yǎng)基100μL，每組重復(fù)做6個復(fù)孔。藥物作用4 h后，除空白組外，每組加入終濃度為2.5 μg/mL的脂多糖100 μL刺激。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，在酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組均值/OD對照組均值×100%。

2.7 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、細(xì)胞刮刮取、培養(yǎng)基內(nèi)吹打后，用含血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.3×106/mL，接種到96孔板上，每孔100 μL細(xì)胞懸液。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去含血清培養(yǎng)液，加入100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞12h，使細(xì)胞周期同步化。棄去無血清培養(yǎng)基，分組，空白對照組：加入200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，模型對照組：加入100 μL終濃度為2.5 μg/mL的脂多糖和100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，給藥組：加入濃度為100、200、400、800、1600、3200 μg/mL的傳統(tǒng)加工生黃柏，傳統(tǒng)加工鹽黃柏，產(chǎn)地加工一體化生黃柏，產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏藥液100 μL和終濃度為2.5 μg/mL的脂多糖100 μL，終體積為200 μL，每組重復(fù)做6個復(fù)孔。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)上清液，加入0.1%中性紅溶液200 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，棄中性紅，用預(yù)溫的PBS洗3遍，每次200 μL，甩干。每孔加入200 μL細(xì)胞溶解液醋酸-無水乙醇(1∶1)，4 ℃靜置過夜，酶標(biāo)儀540 nm處測OD值，并計(jì)算細(xì)胞相對吞噬率。細(xì)胞相對吞噬率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

2.8 ELISA法測定RAW264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量 取4瓶處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、細(xì)胞刮刮取、培養(yǎng)基內(nèi)吹打后，分別用含血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.7×106/mL、1.3×106/mL、1.2×106/mL、1.2×106/mL，分別接種到96孔板上，每孔100 μL細(xì)胞懸液。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去含血清培養(yǎng)液，加入100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞12h，使細(xì)胞周期同步化。棄去無血清培養(yǎng)基，給藥組加200、400、800 μg/mL的傳統(tǒng)加工生黃柏，傳統(tǒng)加工鹽黃柏，產(chǎn)地加工一體化生黃柏，產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏藥液100 μL，空白組和模型組加入無血清DMEM培養(yǎng)基100 μL，每組重復(fù)做6個復(fù)孔。藥物作用4h后，除空白孔外，每組加入終濃度為2.5 μg/mL的脂多糖100 μL刺激。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒說明書用ELISA法測定RAW264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響 從結(jié)果可知，隨著給藥濃度的增加，產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)黃柏飲片的生、制品對RAW264.7細(xì)胞增值率的促進(jìn)作用呈先上升后下降的趨勢，在400 μg/mL時細(xì)胞的增殖率最高，800 μg/mL其次，說明最佳給藥濃度為400 μg/mL。同劑量產(chǎn)地加工一體化生黃柏組與傳統(tǒng)加工生品組比較，產(chǎn)地加工一體化生黃柏飲片組的細(xì)胞增殖率明顯升高，同劑量產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏組與傳統(tǒng)加工鹽品組比較，產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏飲片組的細(xì)胞增殖率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞增長的作用更強(qiáng)。從圖中也可看出產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏組細(xì)胞增殖率高于各給藥組。詳見表1、圖2。

表1 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

續(xù)表1

表1 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；同劑量一體化生品組與傳統(tǒng)生品組比較，#P<0.05，##P<0.01；同劑量一體化鹽品組與傳統(tǒng)鹽品組比較，aP<0.05，aaP<0.01。

3.2 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 從結(jié)果可知，空白組細(xì)胞的吞噬活性最強(qiáng)，與空白組相比，模型組的吞噬活性明顯降低(P<0.01)，表明脂多糖造模成功。同劑量一體化加工生黃柏組與傳統(tǒng)加工生品組比較以及同劑量一體化加工鹽黃柏組與傳統(tǒng)加工鹽品組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)吞噬活性增強(qiáng)，表明產(chǎn)地加工一體化的黃柏和鹽黃柏組細(xì)胞的吞噬活性強(qiáng)于傳統(tǒng)加工的黃柏和鹽黃柏組。詳見表2。

表2 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

續(xù)表

表2 產(chǎn)地加工一體化與傳統(tǒng)加工黃柏飲片對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；同劑量一體化生品組與傳統(tǒng)生品組比較，aP<0.05，aaP<0.01；同劑量一體化鹽品組與傳統(tǒng)鹽品組比較，bP<0.05，bbP<0.01。

3.3 ELISA法測定RAW264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量 與空白組相比，模型組細(xì)胞上清液的TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明顯升高(P<0.01)，說明脂多糖造模成功，使細(xì)胞發(fā)生炎癥，造成炎癥因子和細(xì)胞白介素增加。與模型組相比，各給藥組細(xì)胞上清液的TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明顯降低(P<0.05)，其中，傳統(tǒng)加工鹽炙品組和產(chǎn)地加工一體化生品組和鹽炙品組含量明顯降低(P<0.01)，抗炎效果較好。同劑量產(chǎn)地加工一體化生黃柏組與傳統(tǒng)加工生品組比較，TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明顯降低(P<0.05)，同劑量產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏組與傳統(tǒng)加工鹽品組比較，TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量均明顯降低(P<0.05)，說明產(chǎn)地加工一體化黃柏飲片的抗炎效果更好，其中以產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏的抗炎效果最好，且給藥濃度以400μg/mL為宜，800μg/mL其次。見表3。

表3 RAW264.7細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和NO含量

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；同劑量一體化生品組與傳統(tǒng)生品組比較，aP<0.05，aaP<0.01，同劑量一體化鹽品組與傳統(tǒng)鹽品組比較，bP<0.05，bbP<0.01。

4 討論

巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞之一，在機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[12]。脂多糖不僅可以對靶細(xì)胞有直接損傷作用，而且可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將胞外刺激轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而擴(kuò)大并增強(qiáng)各種炎癥因子的作用[13]。脂多糖可誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α和NO的產(chǎn)生，IL-6和IL-10是由多種免疫和非免疫細(xì)胞分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時會大量分泌[14]。巨噬細(xì)胞表面有多糖的作用靶點(diǎn)，多糖能通過其活化巨噬細(xì)胞,進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能[15]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與空白組相比，模型組細(xì)胞的增殖率和吞噬活性明顯降低，炎癥因子含量明顯升高，給藥組中炎癥因子含量明顯降低，其中以產(chǎn)地加工一體化黃柏飲片組的效果最好。同劑量產(chǎn)地加工生黃柏飲片組與傳統(tǒng)加工生黃柏飲片組相比，其細(xì)胞增殖率和吞噬活性明顯升高，炎癥因子含量明顯降低(P<0.05)，同劑量產(chǎn)地加工鹽黃柏飲片組與傳統(tǒng)加工鹽黃柏飲片組相比，增值率和吞噬活性明顯升高，炎癥因子含量明顯降低(P<0.05)，抗炎效果較好。

綜上所述，產(chǎn)地加工一體化黃柏的抗炎作用優(yōu)于傳統(tǒng)加工黃柏，能明顯降低巨噬細(xì)胞中炎癥因子的含量，其中以產(chǎn)地加工一體化鹽黃柏的效果最好，最佳給藥濃度為400 μg/mL。

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ComparativetheEffectofOriginProcessingIntegrationandTraditionalPhellodendriChinensisCortexonMacrophages

WU Qi1ZHANG Fan2JU Chengguo1,2*JIA Tianzhu1,2

1.School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China；2.Liaoning Research Center of Traditional Chinese Medicine Processing Engineering, Dalian 116600, China

ObjectiveComparing the effect of origin processing integration and traditional Phellodendri Chinensis Cortex on macrophages, discuss the advantages of integrated processing of Phellodendri Chinensis Cortex.MethodsThe origin processing integration and traditional Phellodendri Chinensis Cortex and its processed with salt, we added them with different concentrations in the macrophages cells culture fluid, and then LPS was added after 4 hours, the contents of TNF-α, IL-6, IL-10 and NO in the supernatant were measured after culture of 24 hours, and observed the phagocytosis of macrophages to neutral red.ResultsThe same dose groups compared with the traditional Phellodendri Chinensis Cortex group, the levels of TNF-α, IL-6, IL-10 and NO were significantly decreased (P<0.05) or extremely significant decreased (P<0.01) in the Phellodendri Chinensis Cortex processed with salt and origin processing integration of Phellodendri Chinensis Cortex and enhanced phagocytosis.ConclusionThe integrated processing of Phellodendri Chinensis Cortex can significantly reduce the level of inflammatory factors and increase the phagocytic ability of macrophages to neutral red.

Origin Processing Integration; Macrophages; LPS; Phagocytosis

30種中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制生產(chǎn)一體化技術(shù)規(guī)范研究-黃柏(2015468002)。

吳琦(1992-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幣谥乒に嚺c原理研究。E-mail：1763165176@qq.com

鞠成國(1979-)，男，漢族，博士研究生，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥圃硌芯俊-mail：jcg7092357@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)24-0026-06

2017-11-27 編輯：鄧佳麗)