李晶 余音 劉林紅 黎智 刁慶春 王開振 肖亮 劉素桃

400011重慶市中醫(yī)院皮膚科（李晶、余音、劉林紅、黎智、刁慶春、劉素桃），腎病科（王開振）；湖北省十堰市人民醫(yī)院骨科（肖亮）

·論著·

抑癌基因DKK3對皮膚惡性黑素瘤細胞增殖和凋亡的影響

李晶 余音 劉林紅 黎智 刁慶春 王開振 肖亮 劉素桃

400011重慶市中醫(yī)院皮膚科（李晶、余音、劉林紅、黎智、刁慶春、劉素桃），腎病科（王開振）；湖北省十堰市人民醫(yī)院骨科（肖亮）

目的探討DKK3在人皮膚惡性黑素瘤細胞及組織中的表達及其對黑素瘤細胞A375增殖與凋亡的影響。方法通過反轉(zhuǎn)錄（RT）?PCR及實時定量PCR分析DKK3 mRNA在人惡性黑素瘤細胞系HM、A375、WM451、WM35、SK?MEL?1、Hs?695T和MDA?MB?435s及38例原發(fā)性黑素瘤、4例轉(zhuǎn)移性黑素瘤和20例色素痣組織中的相對表達。分別轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤A375細胞pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3質(zhì)粒（實驗組）和pcDNA3.1（+）?Flag?Vector質(zhì)粒（對照組），RT?PCR 驗證 DKK3的過表達；通過CCK8法和平板克隆實驗分析DKK3對A375細胞增殖的影響，流式細胞儀分析DKK3對A375細胞凋亡的影響，Western印跡檢測A375細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果DKK3 mRNA在WM35細胞系表達下調(diào)，HM、A375、WM451、SK?MEL?1和Hs?695T細胞系表達缺失，MDA?MB?435s細胞高表達。與色素痣相比，DKK3 mRNA在人惡性黑素瘤組織表達降低（P＜0.001）。與對照組A375細胞相比（100%），實驗組A375細胞克隆形成效率明顯受到抑制（23.22%±3.55%）；同時轉(zhuǎn)染后24、48、72 h細胞活性受到明顯抑制（均P＜0.05）。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組A375細胞（G1期，25.38%±2.92%）相比，實驗組A375細胞明顯阻滯于G1期（48.68%±3.92%，P＜0.001），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.001）。與對照組A375細胞相比，實驗組周期凋亡相關(guān)蛋白p21、Bax、活化的parp和活化的Caspase?3表達升高，細胞周期蛋白D1和Bcl2表達降低（均P＜0.001）。結(jié)論DKK3在人皮膚惡性黑素瘤組織中表達下調(diào)，可能作為潛在的抑癌基因參與皮膚惡性黑素瘤的進展。

黑色素瘤；細胞增殖；細胞凋亡；DKK3；抑癌基因

全球腫瘤癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，發(fā)達國家中，皮膚惡性黑素瘤在所有腫瘤中的發(fā)病率高居第8位［1］。皮膚惡性黑素瘤的病因目前尚不完全清楚，可能與紫外線照射、種族、遺傳、化學(xué)致癌物、病毒等因素相關(guān)。尋找新的腫瘤相關(guān)靶基因有著重要意義［2］。DKK3（dickkopf?related protein 3）基因是分泌性腫瘤抑癌基因，在人胃癌［3］、結(jié)腸癌［3］、腎癌［4］、乳腺癌［5］等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但DKK3在人皮膚黑素瘤中的作用尚未見報道。我們檢測DKK3基因在惡性黑素瘤組織和細胞系中的表達，并過表達黑素瘤細胞A375中DKK3基因，分析過表達后細胞增殖、周期及凋亡變化。

資料與方法

一、臨床資料

2014年8月至2016年8月收集重慶市中醫(yī)院皮膚科42例黑素瘤（包括38例原發(fā)性黑素瘤和4例轉(zhuǎn)移性黑素瘤）和20例色素痣組織標本。黑素瘤患者中，24例（57.1%）＞50歲，18例（42.9%）＜50歲；男23例（54.8%），女19例（45.2%）；25例（59.5%）病變位于頭和軀干，17例（40.5%）位于四肢；肢端雀斑樣痣型20例，淺表擴散型3例，結(jié)節(jié)型8例，黏膜型11例；病理分期TNMⅠ+Ⅱ28例占66.7%，Ⅲ期14例占33.3%。色素痣患者中，12例（60%）＞50歲，8例（40%）＜50歲；男13例（65%），女7例（35%）。黑素瘤與色素痣患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過重慶市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。所有皮膚惡性黑素瘤和色素痣病例均經(jīng)本院病理科確診。

二、試劑和儀器

膜聯(lián)蛋白V-熒光素探針/碘化丙錠（Annexin V?FITC/PI）凋亡試劑盒來自上海翊圣生物科技有限公司，CCK8細胞增殖試劑盒來自美國Promega公司，RNA提取試劑盒來自美國Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自美國Promega公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實時定量PCR（qRT?PCR）染料SYBR?Green產(chǎn)自北京諾博萊德科技有限公司。一抗、二抗抗體均來自美國Abcam公司，一抗為鼠抗人DKK3、細胞周期蛋白 D1（cyclinD1）、p21、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved?Caspase?3）、Bax、活化的PARP降解產(chǎn)物（cleaved?parp）、Bcl2單克隆或多克隆抗體，二抗為山羊抗鼠IgG抗體，內(nèi)參是β肌動蛋白。人惡性黑素瘤細胞系HM、A375、WM451、WM35、SK?MEL?1、Hs?695T和MDA?MB?435s來自美國ATCC細胞庫。

三、方法

1.DKK3過表達載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染：DKK3過表達質(zhì)粒及對照空載體來自廣州復(fù)能基因公司。細胞轉(zhuǎn)染步驟同文獻［5］：將A375細胞種植在6孔板中，以Lipofectamine?2000（美國Invitrogen公司）為載體，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3質(zhì)粒（實驗組）和對照空質(zhì)粒（5 μg/孔，對照組），48 h后收集細胞進行相應(yīng)功能實驗。

2.RNA和蛋白提?。篟NA提取試劑盒提取細胞及組織RNA。細胞蛋白提取步驟同文獻［5］，采用BCA測蛋白濃度。所提取的組織樣本檢測濃度后置于-80℃保存。

3.反轉(zhuǎn)錄（RT）?PCR檢測DKK3 mRNA表達：步驟同文獻［3］?？偡磻?yīng)體系10 μl，cDNA為1 μg，目的基因擴增32個循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參照，反應(yīng)23個循環(huán)。DKK3引物序列：正向5′?CACCCTCAAT GAGATGTTCC?3′，反向5′?TGGTCTCATTGTGATAG CTG?3′。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳條帶亮度評估目的基因相對表達量。

4.qRT?PCR檢測DKK3 mRNA：步驟同文獻［2］。使用HT7500生物系統(tǒng)以及SYBR?Green試劑盒。DKK3正向引物：5′?AGGCAGAAGAAGCTGC TGCTAA?3′，反向引物：5′?AGCTGGTCTCCACAGCA CTCACT?3′。以2?ΔΔCt值表示DKK3 mRNA表達水平。

5.CCK8法和平板克隆實驗：CCK8實驗步驟為細胞轉(zhuǎn)染48 h后，計數(shù)實驗組與對照組細胞，以2 000個細胞/孔的密度加入96孔板中，放于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞貼壁后0、24、48、72 h分別更換為100 μl完全培養(yǎng)基，同時每孔加入10 μl CCK8試劑，培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A值），統(tǒng)計作圖。平板克隆實驗：將實驗組和對照組細胞消化離心后計數(shù)，按照每孔300、600、900個細胞的濃度梯度將細胞接種于六孔板中，并分別加入含有G418的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；1～2周后形成明顯的細胞集落，多聚甲醛固定、染色后在顯微鏡下細胞克隆（以50個細胞作為克隆標準），計算實驗組和對照組的細胞克隆比值，統(tǒng)計作圖。

6.流式細胞儀分析細胞周期和凋亡率：參考文獻［2］。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，①收集細胞固定24 h，PI染色后用流式細胞儀分析細胞周期；②收集細胞，結(jié)合緩沖液重懸，分別加入V-熒光素探針和PI混勻，避光30 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡，根據(jù)早期凋亡和晚期凋亡細胞總數(shù)計算凋亡率。

7.Western印跡檢測周期和凋亡相關(guān)蛋白表達：細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，提取蛋白質(zhì)，凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的PBST室溫下封閉1.5 h，分別加入抗 DKK3、cyclinD1、p21、cleaved?Caspase?3、Bax、cleaved?parp、Bcl2及β肌動蛋白的一抗，于4 ℃搖床封閉過夜。第2天常溫下復(fù)溫30 min后，PBST液洗膜，加入封閉液稀釋（1∶2 000）的二抗，室溫下孵育2 h，顯色劑顯色，F(xiàn)usion Advance成像儀曝光，Quantity One軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與β肌動蛋白條帶灰度值之比表示相對表達水平。

四、統(tǒng)計處理

用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件進行分析，各實驗獨立重復(fù)3次，計量資料以±s表示。兩獨立樣本間比較采用雙側(cè)t檢驗；多組數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、DKK3 mRNA在惡性黑素瘤細胞系中的表達

RT-PCR顯示，與色素痣組織相比，DKK3 mRNA在WM35細胞系表達下調(diào)，HM、A375、WM451、SK?MEL?1和Hs?695T細胞系表達缺失，MDA?MB?435s細胞高表達。qRT?PCR顯示，與良性皮膚色素痣相比，DKK3 mRNA在人惡性黑素瘤細胞系中表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），與RT?PCR的結(jié)果一致。見圖1。

圖1 DKK3 mRNA在人惡性黑素瘤細胞系中的表達 1A：反轉(zhuǎn)錄PCR顯示DKK3 mRNA在大部分人黑素瘤細胞系中低表達，在色素痣中高表達。1：標準參照物；2：HM；3：A375；4：WM451；5：WM35；6：SK?MEL?1；7；hS?695T；8：MDA?MB?435s；9、10：色素痣組織標本；1B：實時定量PCR顯示DKK3 mRNA在大部分人黑素瘤細胞系表達下調(diào)。a：與色素痣比，P＜0.001

二、DKK3 mRNA在人惡性黑素瘤組織中的表達

與色素痣（1）相比，DKK3 mRNA表達水平在人惡性黑素瘤組織中顯著減低（0.312 3±0.038 9，t=2.45，P＜0.001）。

三、過表達DKK3基因抑制細胞增殖

RT-PCR證實DKK3在實驗組A375細胞中過表達（圖2A）。CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，A375細胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，實驗組細胞存活率顯著下降（圖2B）。同時平板克隆實驗顯示，與對照組（100%）相比，實驗組A375細胞克隆形成效率（23.22%±3.55%，t=1.75，P＜ 0.001，圖2C）下降。

四、過表達DKK3基因?qū)е翧375細胞周期停滯在G0/G1期并誘導(dǎo)細胞凋亡

流式細胞儀檢測顯示，A375細胞過表達DKK3后，細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，與對照組（25.38%±2.92%）相比，實驗組G1期細胞比例為48.68%±3.92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 3，t=1.96，P＜0.001）。對照組凋亡細胞比例為14.26%±3.41%，實驗組為30.22%±4.89%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4，t=2.1，P＜0.001）。

五、DKK3抑制和促進A375細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達

與對照組相比，實驗組過表達DKK3后，cyclinD1和Bcl2表達下調(diào)，而p21、Bax、cleaved?parp和cleaved?casp3表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖5。

圖2 過表達DKK3抑制黑素瘤細胞A375增殖 2A：RT?PCR示DKK3在實驗組A375細胞中過表達；2B：CCK8實驗顯示，DKK3抑制細胞活性；2C：克隆形成實驗顯示，過表達DKK3抑制細胞增殖

圖3 DKK3過表達后A375細胞阻滯于G1期 3A：對照組；3B：實驗組

圖4 DKK3過表達促進A375細胞凋亡 4A：對照組；4B：實驗組

討 論

wnt信號通路在細胞增殖、分化、免疫、器官形成等病理生理過程中起重要作用，而wnt信號的異常激活可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。DKK3作為wnt信號通路中的負調(diào)控因子在多種腫瘤中低表達，作為抑癌基因在腫瘤的增殖、凋亡、遷移中起著重要作用［5?7］。目前沒有發(fā)現(xiàn)正常的永分化黑素細胞，因此在大量基礎(chǔ)研究中，常常以正常色素痣組織作為陽性對照［2?5］。我們用qRT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)，色素痣DKK3表達明顯高于皮膚惡性黑素瘤。RT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)，黑素瘤細胞系DKK3表達廣泛缺失或下調(diào)，而在色素痣中高表達。因此，DKK3在皮膚惡性黑素瘤中表達下調(diào)，可能作為抑癌基因參與皮膚惡性黑素瘤的進展。

圖5 DKK3過表達對黑素瘤375細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 5A：Western印跡；5B：定量分析各蛋白表達水平。a：兩組間比較，P＜0.001。cyclinD1：細胞周期蛋白 D1；cleaved?Caspase?3：活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；cleaved?parp：活化的PARP降解產(chǎn)物

為進一步確定DKK3是否作為功能性的抑癌基因參與皮膚惡性黑素瘤進展，我們檢測DKK3對惡性黑素瘤細胞增殖和凋亡的影響。CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3質(zhì)粒后，A375細胞在24、48、72 h的細胞活性明顯低于對照組；同時平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，過表達DKK3能夠明顯抑制A375細胞的集落形成。過表達DKK3后A375細胞周期明顯阻滯于G1期，細胞凋亡明顯增加。因此，DKK3可能通過阻滯細胞周期和促進細胞凋亡參與惡性黑素瘤的進展，與文獻［5］報道一致。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，過表達DKK3后A375細胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1表達被抑制，p21表達上調(diào)；而細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved?casp3表達上調(diào)。p21表達與非小細胞肺癌浸潤進展有關(guān)［8?10］，其表達缺失與cyclinD1、CDK4的過表達在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用［11］。Bax和Bcl2表達與腫瘤的凋亡密切相關(guān)，Katkoori等［12］發(fā)現(xiàn)，Bax表達陽性結(jié)腸直腸癌患者較陰性患者預(yù)后好；在未治療的患者中，Bax表達陽性患者的生存期是陰性患者的5倍。Caspase活化是細胞凋亡的重要標志［13］。本實驗中，過表達DKK3基因后，A375細胞p21上調(diào)，cyclinD1下調(diào)，因而促進細胞周期阻滯；而Bax上調(diào)，Bcl2下調(diào)，因而促進細胞周期凋亡，最終抑制腫瘤增殖。

綜上所述，DKK3在人黑素瘤組織中表達下調(diào)，過表達DKK3能夠明顯抑制惡性黑素瘤細胞增殖，同時促進細胞周期阻滯和誘導(dǎo)細胞凋亡。但DKK3在組織中的甲基化現(xiàn)象及與表達的關(guān)系，以及DKK3基因?qū)盒院谒亓黾毎w移和侵襲的影響和相關(guān)分子機制尚需進一步研究。

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Effects of tumor suppressor gene Dickkopf?3 on proliferation and apoptosis of cutaneous malignant melanoma cells

Li Jing,Yu Yin,Liu Linhong,Li Zhi,Diao Qingchun,Wang Kaizhen,Xiao Liang,Liu Sutao
Department of Dermatology,Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China（Li J,Yu Y,Liu LH,Li Z,Diao QC,Liu ST）;Department of Nephrology,Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China（Wang KZ）;Department of Orthopedics,Shiyan People′s Hospital,Shiyan 442000,HuBei,China（Xiao L）

Liu Sutao,Email:284112611@qq.com

ObjectiveTo investigate the expression of Dickkopf?3（DKK3）in human malignant melanoma cell lines and tissues,and to evaluate effects of DKK3 on the proliferation and apoptosis of malignant melanoma cell line A375.MethodsReverse transcription PCR（RT?PCR）and real?time fluores?cence?based quantitative PCR（qRT?PCR）were performed to measure the mRNA expression of DKK3 in human malignant melanoma cell lines HM,A375,WM451,WM35,SK?MEL?1,Hs?695T and MDA?MB?435s,as well as in 38 primary melanoma tissues,4 metastatic melanoma tissues and 20 pigmented nevus tissues.Cultured malignant melanoma A375 cells were divided into 2 groups to be transfected with pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3（experiment group）and pcDNA3.1（+）?Flag?Vector（control group）respectively.The overexpression of DKK3 was verified by RT?PCR.Cell counting kit?8（CCK8）assay and plate colony formation assay were performed to evaluate the proliferative activity of A375 cells,flow cytometry was conducted to detect apoptosis of A375 cells,and Western blot analysis was performed to determine the expression of cell cycle?and cell apoptosis?related proteins.ResultsThe mRNA expression of DKK3 was downregulated in WM35 cells,absent in HM cells,A375 cells,WM451 cells,SK?MEL?1 cells and Hs?695T cells,but upregulated in MDA?MB?435s cells.Compared with pigmented nevus tissues,the mRNA expression of DKK3 was significantly decreased in malignant melanoma tissues（P＜ 0.001）.Compared with the control group（100%）,cell colony formation was markedly suppressed in the experiment group（23.22% ±3.55%）,and the proliferative activity of A375 cells was also significantly inhibited in the experiment group 24,48,72 hours after the transfection（allP＜ 0.05）.Flow cytometry showed that compared with the control group,A375 cells were significantly arrested in G1 phase（48.68% ±3.92%vs.25.38% ±2.92%,P＜0.001）,and the apoptosis rate of A375 cells was significantly increased in the experiment group（P＜ 0.001）.Compared with the control group,the experiment group showed significantly higher expression of p21,Bax,cleaved?parp and cleaved?casp3,but significantly lower expression of cyclin D1 and Bcl2（allP＜ 0.001）.ConclusionDKK3 expression is downregulated in human malignant melanoma tissues,so it may serve as a potential tumor suppressor gene involved in the development of cutaneous malignant melanoma.

Melanoma;Cell proliferation;Apoptosis;DKK3;Tumor suppressor genes

劉素桃，Email：284112611@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.010

2017?05?03）

吳曉初）