田黎明 彭圓 胡榮毅 程楊 姜紅浩 陳紅英 田慶均 張翀 王平

430022武漢，湖北中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院 華中科技大學附屬武漢中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢市第一醫(yī)院皮膚科（田黎明、胡榮毅、程楊、姜紅浩、陳紅英、田慶均）；湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院（彭圓、張翀、王平）

·論著·

H2O2對人皮膚成纖維細胞衰老標記蛋白30及自噬相關蛋白LC3Ⅱ表達的影響

田黎明 彭圓 胡榮毅 程楊 姜紅浩 陳紅英 田慶均 張翀 王平

430022武漢，湖北中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院 華中科技大學附屬武漢中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢市第一醫(yī)院皮膚科（田黎明、胡榮毅、程楊、姜紅浩、陳紅英、田慶均）；湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院（彭圓、張翀、王平）

目的探討H2O2對人皮膚成纖維細胞（NHSF）衰老標記蛋白30（SMP30）以及細胞自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ型（LC3Ⅱ）的影響。方法用150 μmol/L H2O2處理2～4代NHSF 2 h，構建細胞衰老模型作為H2O2組，而未處理的NHSF作為對照組。細胞衰老β半乳糖苷酶（SA?β?gal）染色法檢測衰老細胞比例，間接免疫熒光檢測自噬相關蛋白LC3的表達，反轉錄PCR（RT?PCR）檢測SMP30 mRNA的表達，Western印跡法檢測SMP30和LC3蛋白的表達。結果H2O2組NHSF的SA?β?gal染色陽性率（41.70% ±2.95%）顯著高于對照組（3.03% ±0.25%，t=22.59，P＜0.05）。間接免疫熒光結果顯示，H2O2組NHSF LC3陽性率（12.60%±1.57%）明顯低于對照組（23.67%±3.04%，t=5.61，P＜0.05）。Western印跡顯示，H2O2組LC3Ⅰ/GAPDH比值（0.40±0.02）與對照組（0.41±0.04）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而H2O2組LC3Ⅱ/GAPDH比值（0.20±0.02）明顯低于對照組（0.80±0.03，t=29.69，P＜ 0.05），且H2O2組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（0.51±0.03）亦明顯低于對照組（1.98±0.23，t=10.967，P＜0.05）。H2O2組SMP30 mRNA和蛋白水平（與GAPDH mRNA和蛋白的比值分別為0.16±0.01和0.27±0.02）明顯低于對照組（分別為0.35±0.01和0.63±0.02），均P＜0.05。結論H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3Ⅱ的表達水平，加速NHSF衰老。

皮膚衰老；過氧化氫；成纖維細胞；自噬；衰老標記蛋白30；LC3Ⅱ

在肝臟衰老相關研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的衰老標記蛋白30（senescence marker protein 30，SMP30）［1］，作為β聯(lián)蛋白調控皮膚細胞衰老的重要下游因子，可能介導β聯(lián)蛋白延緩氧化應激所致人皮膚成纖維細胞衰老［2］，但其與人皮膚細胞衰老的具體關系還不清楚。Eliopoulos等［3］研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為真核細胞清除無用細胞器及降解變性蛋白質聚集體的細胞途徑，在各種真核生物衰老過程中發(fā)揮重要作用。我們的前期實驗［4］證實，150 μmol/L過氧化氫（H2O2）處理2～4代正常人皮膚成纖維細胞（normal human skin fibroblasts，NHSF）2 h，可以成功誘導NHSF衰老。為進一步研究H2O2對NHSF衰老相關因子及細胞自噬的影響，在前期研究基礎上，我們采用H2O2誘導NHSF提前衰老，觀察SMP30及自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ型（LC3Ⅱ）表達的變化。

材料與方法

一、材料

T?Gradient Thermoblock PCR儀（德國Denver公司），凝膠影像分析系統(tǒng)Jeldoc2000型（美國BioRad公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美國Gibco BRL公司），細胞衰老相關β半乳糖苷酶（SA?β?gal）染色試劑盒（美國CDK公司），SMP30抗體、3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Santa Cruz生物公司），間接免疫熒光封閉液、異硫氰酸熒光素（FITC）標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（上海碧云天生物技術有限公司），LC3抗體（美國Cell Signaling公司）。

二、方法

1.NHSF分離與培養(yǎng)［4］：分離小兒包皮獲得NHSF，培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，細胞長至80%融合后，采用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）以1∶1比例消化傳代擴增，取2～4代NHSF用于實驗。

2.H2O2處理NHSF誘導皮膚衰老模型：根據(jù)前期實驗［4］，采用150 μmol/L H2O2處理NHSF 2 h誘導人皮膚衰老模型，作為H2O2組；未處理的NHSF作為對照組。

3.SA?β?gal活性測定及細胞形態(tài)觀察［4］：制作細胞爬片，在磷酸鹽緩沖液（PBS）中沖洗，室溫下以2%甲醛/0.2%戊二醛固定3～5 min，PBS清洗，在無CO2、37 ℃條件下以新鮮配制的SA?β?gal染色液孵育2～4 h，最長為12～16 h，中性樹膠封片，光鏡觀察細胞染色情況及細胞形態(tài)。陽性細胞胞質呈淡藍至深藍色。200倍視野下陽性細胞占總細胞的百分比為陽性率。

4.間接免疫熒光檢測LC3的表達［5］：NHSF按實驗分組條件處理2 h后，每組接種5 ml（2×105個/ml）于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，加入免疫熒光封閉液封閉1 h，棄封閉液，加入1∶200稀釋的LC3一抗4℃孵育過夜，棄染液，加入1∶200稀釋的熒光二抗避光室溫孵育2 h，加入DAPI室溫避光孵育20 min，棄DAPI，PBS漂洗后在倒置激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。綠色熒光代表陽性細胞，400倍視野下陽性細胞占總細胞的百分比為陽性率。

5.RT?PCR測定NHSF中SMP30 mRNA表達：Trizol抽提細胞總RNA，RT?PCR檢測對照組和H2O2組NHSF中SMP30 mRNA的表達。采用在線引物設計 軟 件（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/）設 計 人SMP30基因引物，正向：5′?CCGTGGATGCCTTTGAC TAT?3′；反向：5′?TCCAAAGCAGCATGAAGTTG?3′。GAPDH基因，正向：5′?ACCACAGTCCATGCCATCA C?3′；反向：5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′。PCR反應體系和反應條件參考文獻［4］。用凝膠分析系統(tǒng)掃描拍照，檢測各電泳條帶的灰度值，SMP30/GAPDH比值為SMP30 mRNA的相對含量。

6.Western印跡檢測NHSF中SMP30、LC3蛋白表達：參考文獻［4］。在冰上用無線電免疫沉淀反應試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）溶解細胞，旋轉使細胞充分破碎，離心后的上清液分裝到0.5 ml離心管中，測蛋白濃度或放入-70℃保存。取蛋白樣品加入5×變性上樣緩沖液，100 V電壓跑膠，轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫振蕩封閉1 h。分別加入一抗SMP30（1∶200）、LC3（1∶200）、GAPDH（1∶3 000），4℃過夜，吐溫3緩沖液洗膜，每次10 min，洗3次，加入1∶10 000二抗辣根過氧化物酶，室溫振蕩孵育1 h。在PVDF膜上均勻涂抹化學發(fā)光底物，保持2 min。采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值。

7.統(tǒng)計分析：采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組實驗均重復3次，取平均值，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、H2O2處理對NHSF細胞形態(tài)和SA?β?gal活性的影響

150 μmol/L H2O2處理 NHSF 2 h 后，顯微鏡下NHSF排列不規(guī)則，細胞變平、變大，出現(xiàn)空泡，輪廓不清楚，折光性差，符合衰老細胞特征（圖1）。H2O2組SA?β?gal陽性率顯著高于對照組（P＜ 0.05）。見表1。

表1 H2O2處理前后正常人皮膚成纖維細胞中β半乳糖苷酶（SA?β?gal）陽性率及LC3、SMP30 mRNA和蛋白的表達（±s）

表1 H2O2處理前后正常人皮膚成纖維細胞中β半乳糖苷酶（SA?β?gal）陽性率及LC3、SMP30 mRNA和蛋白的表達（±s）

注：n=3

組別H2O2組對照組t值P值SA?β?gal陽性率（%）41.70±2.95 3.03±0.25 22.59＜0.05 LC3Ⅱ陽性率（%）12.60±1.57 23.67±3.04 5.60＜0.05 LC3Ⅱ/GAPDH灰度比值0.20±0.02 0.80±0.03 29.69＜0.05 LC3Ⅰ/GAPDH灰度比值0.40±0.02 0.41±0.04 0.21＞0.05 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度比值0.51±0.03 1.98±0.23 10.97＜0.05 SMP30 mRNA 0.16±0.01 0.35±0.01 24.39＜0.05 SMP30蛋白0.27±0.02 0.63±0.02 26.03＜0.05

二、H2O2處理前后NHSF中LC3的表達

間接免疫熒光結果顯示，H2O2組NHSF中LC3陽性率顯著低于對照組（P＜0.05）。見表1、圖2。

Western印跡結果顯示，H2O2組LC3Ⅱ/GAPDH灰度比值明顯低于對照組（P＜0.05），而LC3Ⅰ/GAPDH比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著低于對照組（P＜0.05）。見表1、圖3。

圖1 光鏡下觀察兩組正常人皮膚成纖維細胞（NHSF）形態(tài)及細胞衰老相關β半乳糖苷酶（SA?β?gal）活性（× 200） 對照組：細胞形態(tài)一致，呈長梭形，核呈卵圓形，呈放射狀、編織狀或漩渦狀排列，輪廓清楚，折光性好；H2O2組：細胞排列不規(guī)則，細胞變平、變大，出現(xiàn)空泡，輪廓不清楚，折光性差，符合衰老的成纖維細胞形態(tài)特征

三、H2O2處理前后NHSF中SMP30 mRNA和蛋白的表達

RT?PCR和Western印跡顯示，H2O2組SMP30 mRNA和蛋白水平均顯著低于對照組（均P＜0.05）。見表1、圖4。

討 論

皮膚衰老不僅能反映機體的健康狀態(tài)，而且極大影響人們的美容意識和心理狀況，因此皮膚衰老研究已成為當前的熱點。H2O2、紫外線等氧化應激可以導致持續(xù)的活性氧（ROS）刺激，進一步加劇氧化應激損害，繼而導致人皮膚細胞衰老，被認為是導致人細胞衰老的重要因素之一［6?7］。我們前期實驗也證實，H2O2可誘導氧化應激損傷，導致NHSF衰老［4］。

圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察兩組正常人皮膚成纖維細胞內自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）的表達（間接免疫熒光染色×400） 綠色熒光顯示LC3表達，綠色熒光越強，LC3的表達量越高，自噬越強。DAPI：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，Merge代表LC3綠色熒光與DAPI藍色熒光的融合

圖3 H2O2處理對正常人皮膚成纖維細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ蛋白表達的影響 H2O2組與對照組比較，LC3Ⅰ蛋白表達無明顯改變，而LC3Ⅱ蛋白表達明顯下調

圖4 H2O2處理對正常人皮膚成纖維細胞衰老標記蛋白30（SMP30）mRNA（4A）和蛋白（4B）表達的影響 H2O2組與對照組相比，SMP30表達明顯下調

SMP30，又稱為鈣調素，是一種新發(fā)現(xiàn)的衰老標記蛋白，它通過調節(jié)細胞內鈣離子的濃度來發(fā)揮生物學功能［1］，同時又是衰老調控基因β聯(lián)蛋白的重要下游調控因子［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高表達β聯(lián)蛋白可以激活衰老的NHSF中SMP30表達，從而延緩人皮膚細胞衰老［2］。國外學者研究也發(fā)現(xiàn)，在β聯(lián)蛋白基因敲除的老鼠中SMP30表達下調，維生素C合成不足，其抗氧化應激能力減弱，自由基所致的損害加速，生命縮短，老鼠細胞衰老加速［9?10］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白調控人皮膚細胞衰老的作用機制中，SMP30表達變化可能影響人皮膚細胞的衰老，為進一步探討SMP30與人皮膚細胞衰老的作用關系，我們進行了相關探索。

一些研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增長，氧化應激水平逐漸提高，SMP30的表達隨之下降［1，11］。對小鼠冠狀動脈痙攣機制研究發(fā)現(xiàn)，SMP30基因敲除后，小鼠生命力下降且細胞氧化應激損傷增強［12］。本研究中，H2O2組SMP30 mRNA和蛋白的表達較對照組的表達明顯下調，并且β-半乳糖苷酶活性在H2O2組較對照組明顯增強，表明H2O2加劇皮膚細胞衰老，繼而導致SMP30表達下調。同時我們還發(fā)現(xiàn)，高表達SMP30對H2O2所致的NHSF衰老表型具有調控作用［13］?？梢姡琒MP30與氧化應激和細胞衰老密切相關，即氧化應激損傷加劇，則SMP30表達減少，皮膚細胞衰老，而SMP30高表達則可以減輕氧化應激損失，延緩皮膚細胞衰老。

自噬是細胞內主要的代謝途徑，可以分解受損的蛋白和細胞器進行能量循環(huán)利用，直接或間接參與衰老及衰老相關的病理生理過程，對保護細胞內環(huán)境穩(wěn)定極為重要［14］。自噬體膜上標志性蛋白質有LC3，LC3分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當哺乳動物的細胞有自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ經泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ，定位于自噬體膜［15?16］。本實驗中Western印跡和間接免疫熒光檢測均顯示，H2O2組LC3Ⅱ的表達明顯低于對照組。王申等［5］發(fā)現(xiàn)，中波紫外線（UVB）誘導的提前衰老成纖維細胞條件上清液可以促使細胞自噬減少，加劇細胞提前衰老。Nopparat等［17］發(fā)現(xiàn)，祛黑素通過激活SIRT1信號通路增強自噬活性繼而有效抑制H2O2誘導的細胞衰老。Tsuchihashi等［18］也發(fā)現(xiàn)，H2O2處理HEI?OC1細胞，導致細胞自噬功能缺失和4EBP1磷酸化，繼而誘導HEI?OC1細胞提前衰老?；谝陨涎芯?，我們推測，在H2O2作用下，NHSF自噬可能受到明顯的抑制，使細胞清除衰老細胞器的能力明顯下降，不利于細胞內穩(wěn)態(tài)的維持，繼而進一步導致皮膚細胞衰老的發(fā)生。

目前國內外有關SMP30與細胞自噬之間的作用關系還不十分清楚。Zhu等［19］研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激損傷導致細胞自噬水平下調。Song等［20］研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因Atg7缺失加重小鼠角質形成細胞內氧化應激損失，導致細胞過早衰老。而本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激損傷同樣可以導致SMP30表達下調，進一步促使細胞衰老。Park等［21］研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導的心肌細胞氧化應激損傷模型中，細胞自噬相關蛋白LC3和SMP30表達同時下調，并認為SMP30可能調控細胞內鈣離子濃度，繼而影響鈣離子介導的細胞自噬信號通路。因此，我們推測，SMP30調控細胞內鈣離子濃度可能與細胞自噬間具有協(xié)同作用，SMP30與細胞自噬交互作用共同抑制氧化應激損傷，延緩細胞衰老。

綜上所述，H2O2誘導的NHSF衰老模型中，SMP30表達明顯下調，細胞自噬相關蛋白LC3Ⅱ受到一定抑制，可能進一步促使NHSF提前衰老，但SMP30、細胞自噬與皮膚細胞衰老間的作用機制，還需進一步研究。

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Effect of hydrogen peroxide on senescence marker protein?30 and autophagy?related protein LC3?Ⅱin human skin fibroblasts

Tian Liming,Peng Yuan,Hu Rongyi,Cheng Yang,Jiang Honghao,Chen Hongying,Tian Qingjun,Zhang Chong,Wang Ping
Department of Dermatology,Wuhan No.1 Hospital,Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China（Tian LM,Hu RY,Cheng Y,Jiang HH,Chen HY,Tian QJ）;College of Basic Medicine,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China（Peng Y,Zhang C,Wang P）

Wang Ping,Email:pwang@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the effect of hydrogen peroxide（H2O2）on a senescence marker protein?30（SMP30）and an autophagy?related protein microtubule?associated protein 1 light chain 3 typeⅡ（LC3?Ⅱ）in normal human skin fibroblasts（NHSFs）.MethodsNHSFs were isolated from the foreskin of children,and subjected to culturein vitro.The second?to fourth?passage NHSFs were treated with 150 μmol/L H2O2for 2 hours to establish a model for cellular senescence,while un?treated NHSFs served as control group.Senescence?associated β?galactosidase（SA?β?gal）staining was performed to determine the percentage of senescent cells,indirect immunofluorescence assay to determine the expression of the autophagy?related protein LC3,reverse transcription PCR（RT?PCR）to measure the mRNA expression of SMP30,and Western blot analysis to measure the protein expression of SMP30 and LC3.ResultsThe percentage of senescent（SA?β?gal?positive）cells was significantly higher in the H2O2group than in the control group（41.70% ±2.95%vs.3.03% ±0.25%,t=22.59,P＜0.05）.Indirect immunofluorescence assay showed that the percentage of LC3?positive cells was significantly lower in the H2O2group than in the control group（12.60% ±1.57%vs.23.67% ±3.04%,t=5.61,P＜0.05）.As Western blot analysis showed,no significant difference in the expression of LC3?Ⅰ（LC3?Ⅰ/glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase［GAPDH］ratio）was observed between the H2O2group and control group（0.40±0.02vs.0.41±0.04,P＞0.05）,while the H2O2group showed significantly lower expression of LC3?Ⅱ（LC3?Ⅱ/GAPDH ratio:0.20± 0.02vs.0.80± 0.03,t=29.69,P＜ 0.05）and lower LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰratio（0.51±0.03vs.1.98±0.23,t=10.967,P＜0.05）compared with the control group.Moreover,the mRNA and protein expression of SMP30（SMP30/GAPDH ratio）was significantly lower in the H2O2group than in the control group（mRNA:0.16±0.01vs.0.35±0.01;protein:0.27±0.02vs.0.63±0.02,bothP＜0.05）.ConclusionH2O2can decrease the expression of SMP30 and LC3?Ⅱ in NHSFs,and accelerate the senescence of NHSFs.

Skin aging;Hydrogen peroxide;Fibroblasts;Autophagy;SMP30;LC3?Ⅱ

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81101212,81574037,81674039）;China Postdoctoral Science Foundation（2016M602271）;Natural Science Foundation of Hubei Province of China（2012FFC83,2015CFB577）;Science Foundation of Health and Family Planning Commission of Hubei Province（WJ2015MB203）;Science Foundation of Health and Family Planning Commission of Wuhan Municipality（WX12B20,WX16D30）;Training Project for Young and Middle?aged Core Talents of Health System of Wuhan City（2015）

王平，Email：pwang@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.009

國家自然科學基金（81101212、81574037、81674039）；中國博士后科學基金（2016M602271）；湖北省自然科學基金（2012FFC83、2015CFB577）；湖北省衛(wèi)生計生委科學基金（WJ2015MB203）；武漢市衛(wèi)生計生委科學基金（WX12B20、WX16D30）；武漢市中青年醫(yī)學骨干人才培養(yǎng)工程基金（2015）

2016?12?19）

周良佳 顏艷）